酶**分析（EnzymeImmunoassay,EIA）是標(biāo)記**分析中的一項重要技術(shù),是以酶標(biāo)記的抗體（抗原）作為主要試劑，將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化底物反應(yīng)的高效性和專一性結(jié)合起來的一種**檢測技術(shù)。作為經(jīng)典的三大標(biāo)記技術(shù)之一,酶**技術(shù)在檢驗醫(yī)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用并不斷得到更新，不斷和其他先進技術(shù)如熒光、發(fā)光技術(shù)以及儀器自動化相融合，日臻完善,許多自動化儀器實際上是EIA技術(shù)和其他現(xiàn)代化技術(shù)的復(fù)合體，其分析敏感度已達到甚至大大超過放射**分析(Radioimmunoassay,RIA)的水平，因試劑穩(wěn)定無放射性污染且分析形式日趨多樣化，簡易靈活，臨床應(yīng)用廣泛而倍受重視。

一、酶**分析的技術(shù)進步

近年來，EIA技術(shù)取得了顯著的發(fā)展，主要表現(xiàn)在以下方面：

1、繼單克隆抗體后的第三代抗體基因工程抗體的應(yīng)用，明顯地提高了檢測的特異性，基本消除了抗原、抗體間的非特異**叉反應(yīng)，保證了分析的準(zhǔn)確性?？贵w制備技術(shù)的進步，使試劑的生產(chǎn)制備得以規(guī)?；?，檢測范圍日益擴展，小分子抗原、半抗原的檢測成為事實。

2、 分析方式的改進與多樣化提高了試驗的敏感性。

（1）除早期的競爭法，間接法外，又發(fā)展了雙抗原夾心法測抗體，偶聯(lián)酶標(biāo)記法測抗原，橋聯(lián)酶**分析，酶放大**分析技術(shù)等，后者應(yīng)用了生物素-親和素系統(tǒng)，底物循環(huán)放大系統(tǒng)，酶-抗酶放大系統(tǒng)及酶偶聯(lián)放大系統(tǒng)等。

（2）由于酶標(biāo)記技術(shù)的進步，標(biāo)記酶的應(yīng)用已從過氧化物酶，擴展到堿性磷酸酶，β半乳糖苷酶，尿素酶，葡萄糖6磷酸脫氫酶，葡萄糖氧化酶，蘋果酸脫氫酶，至今有二十多種酶被應(yīng)用于EIA，但應(yīng)用*多的仍然是辣根過氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP）和堿性磷酸酶（Alkalinephasphotase，ALP）。

（3） 酶**分析與其它標(biāo)記**分析相結(jié)合如與熒光**分析（Fluorescence Immunoassay,FIA）結(jié)合形成熒光酶**分析（Fluorescence Enzyme Immunoassay，F(xiàn)EIA），酶促放大時間分辨熒光**分析（Enzyme-am-plified time-resolvedfluoroimmunoassay ，EATRFIA），EIA與化學(xué)發(fā)光**分析（Chemiluminescenceimmunoassay，CLIA）結(jié)合形成酶—化學(xué)發(fā)光**分析，增強化學(xué)發(fā)光酶**分析（ECLEIA）。EIA與聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合形成的PCR-EIA分析等。

（4）改進固相載體的技術(shù)

傳統(tǒng)ELISA應(yīng)用的固相載體是聚苯乙稀微孔板，聚苯乙烯珠或條，后發(fā)展為硝酸纖維素膜、活化濾紙、硅片、尼龍、利用高分子材料合成的各種固相微粒等。為提高固相表面的結(jié)合容量，增加結(jié)合物的范圍而改造聚苯乙烯的表面，如用化學(xué)偶聯(lián)法導(dǎo)入功能性醛基、?；⑼榘坊纫愿玫嘏c蛋白質(zhì)，多肽的羧基結(jié)合，用位點導(dǎo)向性共價偶聯(lián)法引入親和素，蛋白A，多聚賴氨酸等，以牢固地捕獲蛋白或多肽，超平整聚苯乙烯表面的制備，克服了表面粗糙帶來的不均一性，達到平均粗糙度只有2A+的超平整平面，實現(xiàn)了對蛋白的結(jié)合容量大，脫附率低，孔間均一性好，使試驗精密度達5%。應(yīng)用于雙抗體夾心法時，聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，可以增加其吸附性能特別是對**球蛋白的吸附性能。近年美國Corning公司研制成功表面經(jīng)琥珀酰亞胺酯活化酶標(biāo)板，其質(zhì)量達到氨基活化相似水平。

（5）分析方法的**如同步ELISA法測定多種抗體是將抗原包被在與微孔相匹配的釘板的釘子上，蓋上釘板的同時與微孔內(nèi)的所需標(biāo)本、試劑反應(yīng)，是又一種改良ELISA。利用抗體和抗抗體能形成多層復(fù)合物的特性，將常規(guī)二步溫育法改為一步溫育測定法，使檢測時間大為縮短，現(xiàn)在已廣為應(yīng)用。
 

二、酶**分析在方法學(xué)上與現(xiàn)代化技術(shù)的融合發(fā)展

酶**測定具有高度敏感性、特異性，而且它的試劑比較穩(wěn)定，操作簡單且無放射性危害，更由于現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，抗原抗體制備和酶標(biāo)記技術(shù)的完善，特別是商品試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化和自動化儀器的應(yīng)用，使其成為一種適用于各級檢驗部門的**標(biāo)記技術(shù)。隨著檢驗醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，酶**測定不斷與現(xiàn)代化技術(shù)的融合中得到發(fā)展。

1、斑點-ELISA斑點-ELISA的原理與ELISA的區(qū)別在于用對蛋白質(zhì)有極強吸附力的硝酸纖維素膜代替塑料制品作為固相載體，酶作用底物后在硝酸纖維素膜上形成有色沉淀而使膜著色。它的靈敏度較一般ELISA高6～8倍、可達ng水平，試劑用量小，不需其它設(shè)備條件。

2、**印跡法**印跡法是將電泳與ELISA結(jié)合起來的一種方法，分為電泳、轉(zhuǎn)印、酶**測定三個階段。**印跡法結(jié)合了電泳的高分辨率和酶**測定的高敏感性和特異性，是一種能用于分析樣品組分的**學(xué)測定方法。

3、發(fā)光酶**測定發(fā)光酶**測定與一般EIA的區(qū)別是酶所催化的底物是發(fā)光劑。產(chǎn)物不是一般EIA的有色物質(zhì)，而是發(fā)光產(chǎn)物，所發(fā)出的光可用特定的儀器測定。常用HRP和AP作為標(biāo)記酶與其發(fā)光底物作用進行分析。

4、增強發(fā)光酶**分析　增強發(fā)光酶**分析(enhaned luminescene enzyme immunoassay,ELEIA)是EIA技術(shù)的新發(fā)展。其特點是酶促增強發(fā)光信號，并穩(wěn)定和延長發(fā)光信號時間。既保持發(fā)光**分析的高靈敏度，又克服了傳統(tǒng)發(fā)光酶**分析所發(fā)信號時間短的缺點，目前國外已實現(xiàn)自動化分析。

5、BAS-酶聯(lián)**吸附試驗BAS-酶聯(lián)**吸附試驗是將生物素-親和素（BAS）放大系統(tǒng)與ELISA結(jié)合起來的一種技術(shù)。生物素（B）有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中一個可以和親和素結(jié)合，另一個可以和包括酶、抗原（抗體）的多種物質(zhì)結(jié)合。親和素（A）有4個可與生物素穩(wěn)定結(jié)合的亞基，此為放大系統(tǒng)的關(guān)鍵，即有1個親和素就能結(jié)合4個生物素，親和素也可被酶標(biāo)記。

在BAS的應(yīng)用中正是利用了生物素和親和素的這些特點，設(shè)計了兩類反應(yīng)類型：一類是以游離親和素為“橋”，分別連接生物素化抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)和酶標(biāo)生物素。此種類型有BAB法和ABC法，另一類是直接用標(biāo)記親和素連接生物素化抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)，此種類型有BA法。這種通過BAS放大作用可將更多的酶聚集在固相載體上，使酶**技術(shù)檢測的靈敏度進一步得到提高。

6、酶促熒光放大**分析技術(shù)（Fluorescence Enzyme Immunoassay,FEIA）原理是利用具有潛在熒光的底物作為酶標(biāo)物催化放大的顯示系統(tǒng)，由于累積放大和熒光的高敏感性，使方法學(xué)的靈敏度提高很多。

7、酶促放大時間分辨熒光**分析（EATRFIA）其突出特點是引入了時間分辨熒光**技術(shù)，有利于排除特異熒光的干擾，并經(jīng)酶促信號放大，增強了測量的特異性。
 

三、 酶**分析技術(shù)的自動化

20世紀(jì)50年代生化自動分析儀就取得實際應(yīng)用。由于酶**測定技術(shù)上的特殊性，直到20世紀(jì)80年代后才有自動化分析系統(tǒng)問世，目前我國全自動酶標(biāo)儀市場基本上被進口品牌獨占天下。按分析過程的不同，酶**測定可分為均相（homogenous）和異相（heterogenous）兩大類。

1、均相酶**測定及其自動化均相酶**測定也稱非固相或液相**測定，用于小分子物質(zhì)特別是**濃度的測定。模式為競爭法，即標(biāo)記的抗原與標(biāo)本中的抗原競爭結(jié)合特異性抗體，然后進行標(biāo)記物的測定。在特定的情況下，與抗體結(jié)合的標(biāo)記物失去其特性，因此不需將結(jié)合的（B）和游離的（F）分離即可直接測定F中標(biāo)記物的量。

1972年Syva公司開發(fā)的酶擴大**測定技術(shù)（Enzyme-multiplied immunoassaytechnique，EMIT）和1992年Microgenics公司開發(fā)的克隆酶供體**測定（Clone enzyme donorimmunoassay，CEDIA）均屬均相酶**測定，這兩種方法的試劑在生化自動分析儀即可進行標(biāo)本的檢測。因而專用于EMIT和CEDIA的全自動分析儀較少。

2、異相**測定及其自動化

大部分標(biāo)記**測定均屬異相。*常用的B和F的分離手段為固相載體的洗滌，但在臨床化學(xué)測定中無此步驟。70年代初，Engvall和Perlaman等學(xué)者**創(chuàng)建非均相酶**測定技術(shù)，也稱固相酶**測定即酶聯(lián)**吸附劑測定（Enzymelinked immunosorbentassay），通用的名稱為ELISA，在ELISA中通常用聚苯乙烯為固相載體，有微孔板、小管、小珠、微粒、磁性微粒等類型。不同形式的固相載體要求不同的洗滌裝置。因此異相**測定的自動化不能借助于生化自動分析儀，各種方法均有其特殊的自動分析系統(tǒng)，下面作幾方面介紹。

（1） 微孔板式自動分析儀

不同廠家生產(chǎn)的板式ELISA試劑種類繁多，但均采用規(guī)格統(tǒng)一的8×12的96孔微板。因此儀器廠生產(chǎn)的板式ELISA自動分析儀均為"開放式"的，即適用于各家的試劑產(chǎn)品。微孔板每一孔的徹底清洗是ELISA的關(guān)鍵，亦是自動分析的難點。因此直至近年才有全自動的板式酶免分析儀問世。Bio-Rad公司的CODA自動酶**分析儀以及更為智能化的EVOLIS酶免分析儀、Dynex公司的DSX、DIAS、DiasUltrs全自動酶標(biāo)分析系統(tǒng)均可同時進行多塊微板的全自動測定。Bio-Tek公司的Fastrack智能型酶標(biāo)板處理系統(tǒng)可與寶特系列讀板機、洗板機和液體處理系統(tǒng)聯(lián)合使用。Tecan公司的大型全自動酶免一體機--瑞士TECAN，為全自動平臺，雙機械臂同時工作，全部過程無須人工干預(yù)，全自動微板處理系統(tǒng)RMP（RoboticMicroplateProcessor），能夠完成從標(biāo)本分配到*后結(jié)果的全部過程，適合于中大規(guī)模具有多種實驗項目的實驗室。經(jīng)過幾年的發(fā)展許多板式酶免分析儀已經(jīng)具備真正意義上的全自動分析處理無人職守系統(tǒng)。MicrolabF.A.M.E全自動酶免處理系統(tǒng)是瑞士HAMILTON公司生產(chǎn)的一套完全自動化的酶標(biāo)處理系統(tǒng),它可以執(zhí)行ELISA試驗中所有必需的處理步驟,同時該儀器也是一套開放系統(tǒng),可同時處理各個廠商的不同ELISA試驗項目,具有操作靈活簡便,處理能力大及日常維護方便等特點，是目前比較不錯的一套系統(tǒng)。

（2）其他形式固相載體的自動分析儀

微孔板以外的固相載體形式，其自動分析系統(tǒng)均為試劑與儀器配套型的。

管式載體的特點是小管可同時作反應(yīng)和比色的容器。如BoehringerMannheim公司開發(fā)的ES300型分析儀、ES600型全自動EIA分析儀屬此種類型，但自該公司并入Roche公司以后，各型ES儀器已停止生產(chǎn)。

Abbott公司*早采用0.6cm直徑的小珠作為載體，小珠放在相應(yīng)大小的塑料孔盤中滾動沖洗，屬半自動類型。Roche公司的COBASCOREⅡ自動分析儀則采用粒徑較小的小珠為固相載體，以辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體，以TMB為顯色底物，可檢測40多個項目，為全自動的分析系統(tǒng)。

Abbott公司應(yīng)用膠乳微粒作為載體的MEIA（微粒子酶**測定）自動分析系統(tǒng)較小珠型更為先進，膠乳微?？晌皆诓ＡЮw維膜上進行洗滌。這種自動分析系統(tǒng)稱為IMx，現(xiàn)在與TDx合并組成全能型的Axsym系統(tǒng)。

磁性微粒表面積大，可用磁鐵吸引進行分離，是較為理想的載體。瑞士Serono公司的SEROZYME型酶**分析儀屬此類型。這種載體已被其他標(biāo)記**測定所采用。
 

四、酶**分析技術(shù)和其他分析技術(shù)在自動化儀器中的聯(lián)合應(yīng)用

1、化學(xué)發(fā)光酶**測定

這是采用化學(xué)發(fā)光劑作為酶反應(yīng)底物的酶標(biāo)記**測定。經(jīng)過酶和發(fā)光兩級放大，具有很高的靈敏度。Amersham公司早期開發(fā)了以過氧化物酶為標(biāo)記酶、以魯米諾為發(fā)光底物、并加入發(fā)光增強劑以提高敏感度和發(fā)光穩(wěn)定性的化學(xué)發(fā)光酶**測定系統(tǒng)AMERLITE，經(jīng)Johnson& Johnson 公司改良后商品名為VITROSEci全自動任選式增強化學(xué)發(fā)光**分析系統(tǒng)，此儀器將酶**技術(shù)，生物素親合素技術(shù)和增強化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合。以辣根過氧化物酶標(biāo)記抗原或抗體，以塑料小孔管為固相載體，魯米諾為化學(xué)發(fā)光劑。關(guān)鍵技術(shù)是應(yīng)用了發(fā)光增強劑，使發(fā)光強度增加千倍，時間延長且穩(wěn)定。美國貝克曼庫爾特公司(BecmanCoulter)的Access全自動微粒子酶放大化學(xué)發(fā)光**分析系統(tǒng),該系統(tǒng)是由美國貝克曼公司和法國巴斯德研究院合作設(shè)計生產(chǎn)的。該系統(tǒng)以堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體、以磁性微粒子為固相載體,用AMPPD(Diomums)作為化學(xué)發(fā)光劑,這種化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光穩(wěn)定、持續(xù)時間長,因此比閃爍發(fā)光容易控制。類似的分析系統(tǒng)有DiagnosticProduction Corporation公司的IMMULITE2000型，全自動任選式酶標(biāo)記抗原或抗體，以AMPPD（Dioxeten）作為發(fā)光物，以塑料珠為固相載體。測定原理與貝克曼公司的Access基本相同。

2、酶促熒光放大**分析技術(shù)

法國梅里埃公司的VIDAS全自動熒光酶標(biāo)**測試系統(tǒng)，系統(tǒng)采用雙抗夾心法以堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體,用塑料吸管(SPR)為固相載體,以4-甲基傘型酮磷酸鹽(4-MIjP)為發(fā)光劑、美國Nexct公司的AuraFlex采用磁珠法和標(biāo)記酶直接催化發(fā)光底物發(fā)光（AKP標(biāo)記，4-MUP為底物）。

3、酶促放大時間分辨熒光**分析（EATRFIA）美國MD公司(Molecular DevicesCorporation)的微孔板式熒光酶標(biāo)儀SPECTRAmax瓽EMINIXS，是頭個應(yīng)用雙單色光連續(xù)波長系統(tǒng)于微孔盤，熒光、冷光和時間分辨熒光三合一的機型。能從事終點測讀、動力學(xué)測讀、光譜掃描和細胞計數(shù)實驗，采取多項設(shè)計，降低激發(fā)光反射的干擾，微孔盤塑料、樣品組成物和溶劑（包括水）本身含有的螢光物干擾。

4、微粒子酶**分析技術(shù)（Microparticle enzymeimmunoassay,MEIA）方法科學(xué)、試劑儀器穩(wěn)定、靈敏度高、定量線性范圍寬等優(yōu)點，如美國Abbott公司IMX全自動**熒光分析儀，反應(yīng)*終形成微粒上包被的抗體-被測物-堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗夾心復(fù)合物，將其轉(zhuǎn)移到玻璃纖維柱上用緩沖液洗滌,再加入底物進行測定，有配套試劑供應(yīng)。Abbott公司的AXSYM全自動快速**分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)綜合使用了微粒子捕捉酶**分析技術(shù)(MEIA)、熒光偏振**分析技術(shù)(F凹的,可測定**、腫瘤標(biāo)志物、肝炎、病毒標(biāo)志物、維生素和各種****濃度等)。
 

五、酶**分析的局限性

1、酶**分析檢測的特異性實際上決定于單克隆抗體所針對的抗原決定簇。因而受試劑中包被所用抗原抗體的純度、特異性，酶標(biāo)記物的穩(wěn)定性、特異性、純度、親和力以及制備工藝等諸多因素的影響，故對檢測試劑盒應(yīng)嚴(yán)格比較和選定。固然，其他標(biāo)記**分析方法也有此類問題，但EIA試劑盒的供應(yīng)廠商數(shù)量*多，應(yīng)予注意。

2、在酶**分析測定結(jié)果中目前所測的胰島素或C肽，近年發(fā)現(xiàn)是該物質(zhì)及其前體的混合物就是受抗體局限的明顯例子，是由于有交叉的抗原性而難以分開，因此通常檢測的只能稱為“**反應(yīng)性”胰島素或C肽，這使得我們需重新評價過去對所測的胰島素或C肽的認識，并致力于“真”或“純”胰島素、C肽的測定，類似的情況可能還會發(fā)現(xiàn)。

3、酶**分析以固相反應(yīng)為主，在測定中要注意克服固相不同部位包被抗原（抗體）量不一致引起的表面效應(yīng)，溫育時要防止邊緣孔與中心孔反應(yīng)條件不一致引起的邊緣效應(yīng)，以及抗原、抗體間比例不匹配可能引起的鉤狀效應(yīng)，必須引起注意的是操作簡易的“一步法”常比“二步法”易發(fā)生鉤狀效應(yīng)。

4、固相材料存在非特異性吸附，標(biāo)本溶血或冰箱貯存可釋放過氧化物酶，冰箱貯存時間過長可導(dǎo)致血清IgG聚合，均容易引起本底偏高，甚至嚴(yán)重干擾測定。需要指出的是隨著技術(shù)進步和儀器自動化程度越來越高，這些缺陷在自動化程度較高的儀器和工作量較大的實驗室中已不十分明顯，但在半自動化儀器和標(biāo)本量少需冰箱貯存時，這些缺陷還是顯而易見的?？傊?，隨著科學(xué)發(fā)展和技術(shù)**，酶**分析技術(shù)必將越來越完善，自動化程度越來越高，準(zhǔn)確度和精密度越來越好，定將為人類的健康事業(yè)作出更大的貢獻。