夾心ELISA
1. 溶液準備：
包被液：50mM Na2CO3 （ pH9.6 ）， 20mMTris-HCl （pH8.5 ） 或10mM PBS （ pH7.2 ）
封閉液：一般封閉用BSA、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠等
洗滌液：0.02-0.05%Tween-20的0.1M磷酸鹽緩沖液或者Tris鹽緩沖液 （ pH7.4 ）
AKP偶聯(lián)的鏈球菌親和素溶液：用1×封閉液稀釋酶偶聯(lián)物
2. 實驗程序：
1 ） 將捕獲抗體包被液稀釋至相應(yīng)的濃度。
2 ） 在對應(yīng)的孔中加入100μl抗體溶解液，室溫孵育2h或4℃過夜。
3 ） 倒空液體并拍干殘留液體，用300μl洗滌液清洗兩次。
4 ） 每個孔中加300μl封閉液，孵育1h.
5 ） 倒空液體并拍干殘留液體，用300μl洗脫液清洗兩次。
6 ） 每個孔中加100μl生物素標記的檢測抗體，37℃孵育1h或室溫孵育3h.
7 ） 倒空液體并拍干殘留液體，每個孔中加滿洗滌液，倒空液體并拍干殘留液體，重復(fù)3次。
8 ） 每個孔中加100μl AKP偶聯(lián)的鏈球菌親和素，室溫孵育1h.
9 ） 倒空液體并拍干殘留液體，每個孔中加滿洗脫液，倒空液體并拍干殘留液體，重復(fù)3次。
10 ） 用洗滌液浸泡5min，拍干殘留液體，這一步對于減少背景信號是很重要的。
11 ） 每個孔中加滿洗滌液，倒空液體并拍干殘留液體，重復(fù)5次。
12 ） 每個孔中加100μl底物，顯色30min并立即在405-410nm讀數(shù)。
