酶聯(lián)**分析夾心法檢測(cè)人干擾素(α2a,α2b)
重組人α2a/α2b干擾素(rHuIFN-α2a、rHuIFN-α2b)生產(chǎn)流程中不可缺少的一環(huán)是產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控，通常采用的是HEp-2/VSV或Wish/VSV系統(tǒng)檢測(cè)干擾素的生物活性。此系統(tǒng)常由于VSV或細(xì)胞的影響而不夠穩(wěn)定，且檢測(cè)周期較長(zhǎng)。我們用自制的2種針對(duì)rHuIFN-α2a和rHuIFN-α2b的單克隆抗體(McAb)建立了定量檢測(cè)rHuIFN-α2a和rHuIFN-α2b的雙McAb夾心ELISA，敏感性達(dá)60pg/ml，結(jié)果與生物學(xué)活性檢測(cè)相對(duì)應(yīng)。試用于rHuIFN-α2a生產(chǎn)中的質(zhì)量控制取得了滿意的結(jié)果。此試劑盒也能檢測(cè)人體產(chǎn)生的天然α干擾素，有用于基礎(chǔ)和臨床**研究的潛力。

一、原理

選用2種針對(duì)rHuIFN-α2a和rHuIFN-α2b分子不同表位的McAb，1種McAb作為包被抗體，另1種McAb標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶(HRP)作為結(jié)合物，催化底物顯色。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待檢標(biāo)本的含量。

二、試劑盒提供試劑(供檢測(cè)22份標(biāo)本)

1、包被抗體：應(yīng)用時(shí)用0.05M,pH9.。6碳酸鹽緩沖液作100倍稀釋。

2、 酶標(biāo)抗體：應(yīng)用時(shí)用0.1％BSA-PBS作200倍稀釋(售出前已稀釋10倍)。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：rHuIFN-α2a(3ng/ml)，用時(shí)用0.1％BSA-PBS作倍比稀釋。

4、ABTS底物：ABTS 1mg＋0.1M,pH5.0檸檬酸緩沖液 2ml 3％ H２O２4μl(臨用時(shí)配)。

三、自備試劑和材料

1、 進(jìn)口96孔或國(guó)產(chǎn)40孔聚苯乙烯ELISA板(敏感性以進(jìn)口板稍好)。

2、0.1M,pH7.4 PBS配其它液體用。

3、 包被緩沖液：0.05M,pH9.6 Na２CO３-NaHCO３緩沖液。 

4、 洗滌液：0.05％Tween 20-PBS.

5、結(jié)合物稀釋液：0.1％BSA-PBS(用于稀釋標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品和結(jié)合物)。

6、底物緩沖液：0.1M,pH5.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液。

7、ELISA讀數(shù)儀等。

四、操作步驟

向ELISA板中加入稀釋好的包被抗體100μl/孔

↓ 4℃ 24～48h

洗3次，加入10倍連續(xù)稀釋的待測(cè)標(biāo)本

(做4個(gè)稀釋度即可)或倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品(6個(gè)稀釋度) 100μl/孔

↓37℃，1h

洗3次，加入稀釋好的酶標(biāo)抗體100μl/孔

↓37℃，45min

洗4次，加入配好的ABTS底物液 100μl/孔

↓RT,30min

測(cè)410nm OD

↓ 

繪標(biāo)準(zhǔn)曲線

五、注意事項(xiàng)

1、 待檢標(biāo)本必須無(wú)污染，無(wú)溶血。

2、標(biāo)本稀釋后加入ELISA板時(shí)，注意從低濃度向高濃度依次加入。

3、結(jié)合物稀釋液和底物緩沖液中禁止加入疊氮鈉。
  



                                                                                                                             from dxy.cn