Transwell侵襲實驗總結(jié)
Transwell侵襲實驗
1 實驗用品：
① Transwell小室：
多種廠家可提供，論壇里常用的是Costar、Corning、BD生產(chǎn)的小室，我們實驗室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boydenchamber、Millipore公司的millicell和雕弓滿月射天狼戰(zhàn)友介紹的Thincert。
這些廠家提供的小室，有的已鋪好基質(zhì)膠，買來就可以用，很方便，但也比較貴，我們實驗室用的Chemicon公司的ECM550系列是已經(jīng)鋪好膠的，質(zhì)量很好，但是非常貴，24孔板配套的小室，每個價格約130元，不推薦給大家。BD也有已包被好的，價格不清楚。Coster和Corning公司生產(chǎn)的小室，是論壇里比較常用的，好像是要自己鋪膠，但據(jù)說每個小室成本只有40左右，應(yīng)該比較適合國情。
Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。不過其實洗洗泡泡還是可以重復(fù)用的。我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基質(zhì)膠，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干凈，用前用紫外里外都照30min。sword01戰(zhàn)友提供的處理方法：用棉簽輕輕擦去膠和反面細胞，清水沖洗，超聲清洗，低擋，30min，清水3×5min，蒸餾水3×5min，室溫涼干，用前紫外線小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×2。
因為我買的是鋪好膠的，所以沒買Matrigel，二次利用的小室只用來做不需要鋪膠的遷移實驗。以前的ChemiconECM550系列，膜很結(jié)實，擦不壞，可以反復(fù)用很多次，但現(xiàn)在的膜已經(jīng)改用一種很薄很脆的材料，一般只能重復(fù)用一次，真黑??！很多戰(zhàn)友說Costar和Corning也是可以重復(fù)用的，大家可以試試。
另外，根據(jù)論壇戰(zhàn)友提供的信息，osmonic公司有專用的膜出售。Transwell小室用過后，可把原來的膜切下，貼上osmonic公司的膜，這樣又可以用了，不過我沒用過，有興趣的可以試試。使用方法：trasnwell小室做一次后，將原來的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用無色較稀的）將osmonic公司的膜貼上，剪掉多余的邊緣。再照紫外。
② 上層培養(yǎng)液：
上層培養(yǎng)液采用無血清培養(yǎng)基，為維持滲透壓，需加入0.05%-0.2% BSA。
③ 細胞：
值得注意的是，有侵襲能力的細胞才可用于Transwell侵襲實驗。建議實驗前先用酶譜法檢測MMPs的表達，特別是MMP-2的表達。如果不清楚細胞MMPs的表達情況，就盲目進行Transwell侵襲實驗，可能會造成不必要的浪費，一次Transwell侵襲實驗花錢少則數(shù)百，多則數(shù)千，并不是筆小數(shù)目，還是小心為妙。另外，為了讓實驗結(jié)果更明顯，可先撤血清讓細胞饑餓12－24h，再進行實驗。
④ 基質(zhì)膠：
常用的是人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel，主要成分為層黏連蛋白和Ⅳ型膠原，生產(chǎn)廠家有BD、美國CollaborativeRsearch公司等。CaoY戰(zhàn)友的帖這么說的：Matrigel是BD公司生產(chǎn)的，是一種細胞外基質(zhì)，4度時是液體，在37度會逐漸凝固成膠狀，不可逆。同樣的東西在
sigma叫ECM。如果購買的小室是已經(jīng)鋪好基質(zhì)膠的，那么Matrigel就不需要購買了。
⑤ 下層培養(yǎng)液：
下層常用含5%－10%
FBS的培養(yǎng)基，具體濃度根據(jù)細胞侵襲力而定，侵襲力弱的細胞可適當提高FBS濃度。下層也可用趨化因子，有戰(zhàn)友將纖維粘連蛋白加入下層培養(yǎng)液作為趨化因子，但個人認為，F(xiàn)BS仍是*合適的。
⑥ 細胞培養(yǎng)板：
常用于Transwell侵襲實驗的細胞培養(yǎng)板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔*常用。細胞培養(yǎng)板沒什么特殊要求，普通的細胞培養(yǎng)板就可以。但要注意，細胞培養(yǎng)板應(yīng)當與購買的Transwell小室相配套。
⑦此外，膜的下室面可涂上纖維粘連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N，Sigma有售），這樣做的目的是使穿過膜的細胞更好地附著在膜上，也可用膠原（collagen）或明膠（gelatin）。很多戰(zhàn)友認為這不是必須的，而且我也是不涂的，細胞照樣貼壁很好。如果貼壁不好的話可以試試看。linanping1979戰(zhàn)友認為，如果培養(yǎng)時間很長（>24h），細胞還是會掉到下室里面去，所以有條件的話，*好還是在膜下層涂上FN。另外，值得一提的是，膜下層涂上FN還有一定的趨化作用。
2．步驟
2．1 Transwell小室制備
2．1．1 無基質(zhì)膠Transwell小室制備
① 包被基底膜：
用50mg/LMatrigel1：8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風干。如果需要在下室面鋪FN的話，可將200ul槍頭的**剪掉，吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原（collagen）的話，一般配成0.5mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。
② 水化基底膜：
吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37℃，30min。
另有tianjin_glioma戰(zhàn)友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel （3.9ug/ul）60-80μl （注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為*好），置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。
2．1．2 有基質(zhì)膠的Transwell小室制備
Chemicon公司的ECM550系列說明書要求，將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300μl預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15－30min，使基質(zhì)膠再水化。再吸去剩余培養(yǎng)液。
2．2 制備細胞懸液
①制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12－24h，進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。
②消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細胞密度至1－10×105，個人認為不要超過5×105。
具體實驗時采用密度要自己摸索，因為不同細胞，其侵襲能力是不同的。個人經(jīng)驗，細胞量過多，穿過膜的細胞會過多過快，如果*后用計數(shù)法統(tǒng)計結(jié)果的話將難以計數(shù)；而過少的話，可能還沒到檢測的時間點，所有的細胞都已穿過，因此*少也要保證在收樣的時候，上室內(nèi)還要有一定量的細胞存在。
個人認為，對照組和處理盡量不要分開計數(shù)，因為細胞數(shù)目的差異會嚴重影響實驗結(jié)果。如果需要對細胞預(yù)處理而不得不分開計數(shù)，那么計數(shù)一定要多重復(fù)幾次，力求準確，盡量保證對照組和處理組細胞密度一致。
2．3 接種細胞
①取細胞懸液100－200μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室對細胞懸液量有不同要求，請參考說明書。24孔板小室一般200μl。
②24孔板下室一般加入500μl含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請參考說明書。這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養(yǎng)板。
③培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)12－48h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數(shù)目的影響也不可忽視。
以我的課題為例，我使用的**不僅會抑制腫瘤細胞侵襲力，還對細胞增殖有明顯抑制。我選擇的**濃度是用MTT篩選出的72h的IC50。用這個濃度處理細胞，24h內(nèi)對細胞增殖并無明顯抑制，但24h后，抑制作用就開始出現(xiàn)了。所以，用這個濃度來做Transwell，處理時間也必須限定在24h內(nèi)，否則一旦**抑制了細胞增殖或者誘導(dǎo)出凋亡，使處理組細胞數(shù)目少于對照組，那么就難以肯定穿過膜的細胞比對照組少，究竟是由于侵襲被抑制引起，還是處理后細胞數(shù)目本身就比對照組少而引起的了。
時間過長不可以，同樣，過短也不行，因為細胞內(nèi)會有一定量的MMPs儲存，短時間內(nèi)可能侵襲能力不會有太大改變。同時從**被吸收進去，進而發(fā)揮作用，影響MMPs表達，到*后釋放到培養(yǎng)基中，還需要一個過程。時間點的選擇可盡量長點，也可選擇多個時間點研究時間依賴效應(yīng)，但前提是這個時間范圍內(nèi)細胞數(shù)目不能有明顯變化。
另外，我看到細胞在小室內(nèi)的形態(tài)不是正常培養(yǎng)貼壁的形態(tài)，而是圓形的，仍是懸浮時的形態(tài)，不過會聚集成團，所以看到細胞不正常貼壁也不要緊張，是正?，F(xiàn)象。在培養(yǎng)過程中，膜下會逐漸有少量小氣泡產(chǎn)生，這是正?，F(xiàn)象，可不予處理，但我遇到過培養(yǎng)一段時間后，膜下出現(xiàn)了大氣泡，幸虧及時發(fā)現(xiàn)，否則后果將非常嚴重。因此，個人建議，*好接種細胞后1－2h把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱里拿出來看看，確信沒有大氣泡產(chǎn)生。
第三節(jié)Transwell的其他應(yīng)用的實驗步驟
1．Transwell腫瘤細胞遷移實驗
過程與Transwell侵襲實驗基本一致，不同的只是不需要鋪Matrigel。個人認為，由于沒有基質(zhì)膠的阻擋，細胞穿過膜的速度較侵襲實驗明顯加快，所以細胞量要更大。我做侵襲實驗的細胞密度是1×105，而遷移實驗的密度是1×106。另外，下層培養(yǎng)液的FBS濃度也可適當下調(diào)，我做侵襲實驗的濃度是5%，遷移實驗的濃度是2.5%。
2．cathywxy戰(zhàn)友的Transwell上皮細胞培養(yǎng)步驟
做了一段時間的原代細胞培養(yǎng)，把經(jīng)驗?zāi)贸鰜砀蠹曳窒硪幌掳桑埓蠹夜餐接懀?/span>
（1） 將雄性wistar大鼠麻醉，開胸，將氣管取出，置于4℃含0.1%胰蛋白酶XIV（Sigma），100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素（Gibco-BRL）、無Ca 2＋、Mg2＋，無血清的MEM。
（2）用無菌的細胞刮棒刮氣管內(nèi)壁，將所得溶液離心后得到游離細胞。
（3）離心后立即用新鮮的上述MEM溶液（含10%胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5%胎牛血清、100U/ml 青霉素和100ug/ml 鏈霉素的LHC-8 medium（Biofluids）沖洗一次。
（4）沖洗過后，將得到的細胞懸液用臺盼蘭測定活力，若存活率大于90%，則將細胞以106/cm2密度接種于可通透的多聚碳濾膜上（12 mmSNAPWELL， Costar），以37°C 5%CO2-95%空氣含5% 胎牛血清（Gibco-BRL） and 100U/ml 青霉素and 100ug/ml 鏈霉素的LHC-8medium孵育6～10天。
（5）孵育后，經(jīng)測定跨上皮電阻在1000~2000Ω之間，即可用于電生理試驗。
顯微鏡下氣管上皮細胞形細胞呈鋪路石狀，圓形核位于中央，生長時常彼此緊密連接成單層細胞片
3. metastasis戰(zhàn)友的TranswellB16細胞的體外遷移實驗
我以前用costar的Transwell做過B16細胞的體外遷移實驗，具體是這么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8um）的下表面涂一層fibronectin（10ug/ml，50ul），37度2小時，PBS洗一遍后，放入預(yù)先每孔加有600ul的培養(yǎng)基（含10%血清）的24孔板內(nèi)，后在Transwell的內(nèi)室加入細胞（100ul，用含0.1%血清的培養(yǎng)基稀釋好自己所需密度），放入培養(yǎng)箱，12-18小時后，取出Transwell，用棉簽擦去PVPF膜靠近內(nèi)室那一面的細胞，另一面的細胞用甲醛室溫固定30分鐘，結(jié)晶紫染色20分鐘，用清水洗3遍以上，后在顯微鏡下觀察細胞，記數(shù)。
4．mci戰(zhàn)友的內(nèi)皮細胞HMEC-1遷移實驗
1%明膠處理的transwell經(jīng)無血清的MCDB131培液于培養(yǎng)箱中平衡1小時后，上室加入100μl用serum-freeMCDB131稀釋的5×104/孔的HMEC及不同濃度的**，下室加入0.6mlserum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激遷移，同時設(shè)置相應(yīng)陰性及陽性對照，置于CO2培養(yǎng)箱中作用8小時，然后棄去孔中培液，用90%酒精常溫固定30分鐘，0.1%結(jié)晶紫常溫染色10分鐘，清水漂凈，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，顯微鏡（Olympus，DP50，Japan）。下觀察并拍照，*后用10%乙酸100μl/孔抽提10分鐘，于600nm處測定OD值。抑制率計算公式為：抑制率（%）=【（OD值給藥組-OD值無刺激陰性對照）/（OD值不加藥陽性對照-OD值無刺激陰性對照）】×100%。
