一、用途

本試劑盒用于定量檢測(cè)大鼠血清中的IL-6的濃度。

二、原理

本試劑盒采用雙抗夾心ELISA法。抗大鼠IL-6單抗包被于酶標(biāo)板上，大鼠標(biāo)本中的IL-6會(huì)與單抗結(jié)合。加入生物素化的抗大鼠IL-6（二抗），它將與結(jié)合在單抗上的大鼠IL-6結(jié)合而形成**復(fù)合物，未結(jié)合的將被洗去。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin將與二抗的生物素結(jié)合，多余的物質(zhì)會(huì)被洗掉。加入TMB顯色。大鼠IL-6的濃度與OD(450nm)成正比。

三、試劑盒組成

酶標(biāo)板(Coated Wells)

48wells

Anti-rat IL-6RBiotin

1 vial

濃縮洗滌液(100X)(Washing Concentrate)

5ml

標(biāo)準(zhǔn)品(Standards)

1 vial

顯色液(TMB Substrate)

6ml

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(Standard Diluent)

7ml

終止液(Stop Solution)

5ml

濃縮酶聯(lián)物（HRP）

1 vial

酶聯(lián)物稀釋液(HRP Diluent)

7ml

生物素稀釋液(Biotin Diluent)

7ml

四、需要但未提供的材料

1、 可在450nm處進(jìn)行讀數(shù)的酶標(biāo)儀；

2、 能**吸取10-200μL的移液器；

3、 可調(diào)多道（8）移液器（50－200μL）；

4、 供可調(diào)多道移液器使用的試劑存放槽；

5、 洗瓶或洗板機(jī)；

6、 蒸餾水或去離子水；

7、 1升的圓柱形量筒；

8、 血清移液器：1和（10或25 mL）；

9、 移液器槍頭；

10、 紙巾；

11、 計(jì)時(shí)器，用以監(jiān)控溫育步驟；

12、 處理池和**劑（例如：0.5% 次氯酸鈉， 10% 家用漂白水）；

五、注意事項(xiàng)

1、 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

2、 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入HRP或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過(guò)程中不要讓微孔干燥掉。

3、 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

4、 底物顯色液應(yīng)呈無(wú)色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。

5、 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。

6、 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

7、 平衡至室溫后再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8、 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。

9、 不能使用過(guò)期產(chǎn)品。

10、 如果可能傳播**，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置。

六、保存

貯藏于2-8°C.

樣品：

在此檢測(cè)中，可使用血清樣品。

七、準(zhǔn)備工作

1、 濃縮洗滌液(100X)用雙蒸水稀釋成1X（至1000ml）。

2、 標(biāo)準(zhǔn)品用1ml標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液復(fù)溶。得到10ng/ml的高濃度標(biāo)準(zhǔn)品。高濃度標(biāo)準(zhǔn)品可保存于-20°C.

3、 將10ng/ml的高濃度標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成一組標(biāo)準(zhǔn)品，如： 5, 2.5, 1.25, 0.625,0.3125,0ng/ml.

4、 配制1x HRP：一支 HRP加入6 ml 酶聯(lián)物稀釋液，混勻。1x HRP*好在臨用前15分鐘配制。

5、 配制1x Biotin：一支Biotin anti rat IL-6加入6 ml Biotin稀釋液，混勻。1xBiotin*好在臨用前15分鐘配制。

八、操作步驟

試劑盒應(yīng)平衡至室溫（20-25°C ）再試驗(yàn)。

取出所需反應(yīng)板，臨用前15分鐘配制工作液

1、 加入100ul標(biāo)準(zhǔn)品(Standards)、100ul血清于相應(yīng)反應(yīng)板孔中。

2、 輕輕混勻30秒，封住板孔，37°C溫育 60分鐘。

3、 洗板：甩盡板內(nèi)液體，用洗滌液洗滌反應(yīng)板（每孔內(nèi)加入350ul洗滌液），并去除水滴（在厚疊吸水紙上拍干）；反復(fù)洗滌5次。

4、 每孔加入100ul 1x Biotin.輕輕混勻30秒，封住板孔，37°C溫育 60分鐘

5、 洗板：甩盡板內(nèi)液體，用洗滌液洗滌反應(yīng)板（每孔內(nèi)加入350ul洗滌液），并去除水滴（在厚疊吸水紙上拍干）；反復(fù)洗滌5次。

6、 每孔加入100ul 1x HRP.輕輕混勻30秒，封住板孔，37°C溫育 30分鐘

7、 洗板：甩盡板內(nèi)液體，用洗滌液洗滌反應(yīng)板（每孔內(nèi)加入350ul洗滌液），并去除水滴（在厚疊吸水紙上拍干）；反復(fù)洗滌5次。

8、 每孔加入100ul TMB顯色液， 輕輕混勻10秒，37°C暗處溫育15±10分鐘。

9、 每孔加入100ul終止液（Stop Solution)。輕輕混勻30秒；30分鐘內(nèi)在450nm處讀OD值。

以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)血清樣品的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

九、舉例

十、注意事項(xiàng)

1、作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，要扣除標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液造成的本底；如果標(biāo)本用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋，也要扣除標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液造成的本底，如果標(biāo)本未用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋，標(biāo)本不需扣除標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液造成的本底。

2、 生物素(Biotin anti rat IL-6) 和濃縮酶聯(lián)物(HRP)用前應(yīng)離心，使液體位于管底。