ELISA雙抗體夾心法
1、原理
ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其**學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其**學活性，又保留酶的活性。受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。加入酶標記的抗原或抗體，通過反應(yīng)也結(jié)合在固相載體上。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。酶的催化效率很高，間接地放大了**反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。
2、特點
某些分泌型蛋白，用siRNA 干擾后可以用ELISA 進行檢測。
3、ELISA 實驗流程示圖（以雙抗體夾心法為例）
4、試劑與耗材
（1） 包被緩沖液 （pH 9.6 0.05 M 碳酸鹽緩沖液）：
（2）洗滌緩沖液 （pH 7.4，0.15 M PBS）：
（3）稀釋液：
（4）終止液（2 M H2SO4）：
（5）底物緩沖液 （pH 5.0）：
（6）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）使用液：
（7）2，2’-連氮基-雙-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液：
（8）抗原、抗體和酶標記抗體：按說明書處理。
（9）標準品：用稀釋液稀釋成梯度濃度溶液。
（10）96 孔聚苯乙烯塑料板 （酶標板）。
2、實驗步驟（雙抗體夾心法）：
（1）包被：用包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1-10 μg/mL。在酶標板反應(yīng)孔中加0.1mL，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。
（2）加樣：加一定濃度稀釋的待檢樣品（同時做空白對照，陰性對照孔及陽性對照）0.1 mL于上述已包被的反應(yīng)孔中，置濕盒中，37℃， 1 hr。用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。
（3）加酶標抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體 （經(jīng)滴定后的稀釋度） 0.1ml。
37℃，0.5 - 1 hr，用洗滌緩沖液洗板3 次，每次3 min。
（4）加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入現(xiàn)配的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃，10 - 30min。
（5）終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入終止液0.05 mL。
（6）結(jié)果判定：將酶標板在酶標儀上，于450 nm （若ABTS 顯色，讀410 nm），讀數(shù)，輸出到Excel 中。
（7）以標準品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，生成標準曲線和直線回歸方程式，根據(jù)公式計算未知樣品的濃度，并記錄。
