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技術(shù)文章

牛血清在細胞培養(yǎng)中的作用以及質(zhì)量要求
牛血清在細胞培養(yǎng)中的作用以及質(zhì)量要求
生物技術(shù)已經(jīng)被世界各國視為一種高技術(shù)，在整個科學技術(shù)中占據(jù)了特殊的顯著地位，特別是生命科學的發(fā)展更離不生物技術(shù)，生命科學的發(fā)展備受各國的重視。我國在很多大學中都設(shè)立了生命科學院。現(xiàn)代生物技術(shù)一般認為包括基因工程技術(shù)、細胞工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)，而這些技術(shù)的發(fā)展幾乎都與細胞培養(yǎng)有密切關(guān)系，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展，細胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價值。比如基因工程**或疫苗在研究生產(chǎn)過程中很多是通過細胞培養(yǎng)來實現(xiàn)的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO細胞作為載體；細胞工程中更是離不細胞培養(yǎng)，雜交瘤單克隆抗體，完全是通過細胞培養(yǎng)來實現(xiàn)的，既使是現(xiàn)在飛速發(fā)展的基因工程抗體也離不開細胞培養(yǎng)。正在倍受重視的基因**、體細胞**也要經(jīng)過細胞培養(yǎng)過程才能實現(xiàn)，發(fā)酵工程和酶工程有的也與細胞培養(yǎng)密切相關(guān)?？傊毎囵B(yǎng)在整個生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起到了很關(guān)鍵的核心作用。細胞培養(yǎng)的發(fā)展，培養(yǎng)基的質(zhì)量又是關(guān)鍵，而培養(yǎng)基的主要成份中動物血清對細胞的生長繁殖發(fā)揮著重要甚至是難以替代的作用。在動物血清的應(yīng)用中牛血清又是*為廣泛的，所以牛血清是醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品中重要的原材料之一。保證牛血清質(zhì)量也是促進生物制品質(zhì)量提高的重要環(huán)節(jié)。

一、 牛血清在細胞培養(yǎng)基中的主要功能
牛血清是細胞培養(yǎng)中用量*大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。

1.提供對維持細胞指數(shù)生長的**，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物，以及主要的低分子營養(yǎng)物。

2. 提供結(jié)合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他**等，能結(jié)合或調(diào)變它們所結(jié)合的物質(zhì)活力。

3.有些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合，起到**作用。

4.是細胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子來源。

5.起酸堿度緩沖液作用。

6.提供蛋白酶抑制劑，使在細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害。

二、 牛血清的主要成份
血清是一種很復(fù)雜的混合物，其組成成份雖大部分已為人所知，但還有一部分尚不清楚，而且血清組成及含量常
隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異。

1.蛋白質(zhì)是牛血清中主要成份。除包括可攜帶金屬離子、脂肪酸和自身是**類蛋白外主要還有白蛋白，球蛋白。
纖維粘連素 細胞促進細胞附著；
α2 巨球蛋白 抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白 促細胞附著；轉(zhuǎn)鐵蛋白 能結(jié)合鐵離子，減少其毒性
和被細胞利用。

2.多肽：血小板促生長因子能促細胞分裂，是多肽家庭的主要成員之一，是主要的促細胞增殖因子；成纖維細胞
生長因子、表皮細胞生長因子、神經(jīng)細胞生長因子等，血清中含量雖很少，但對細胞生長也有一定作用。

3.**：**對細胞的作用是多方面的。
胰島素：促進細胞攝取葡萄糖和氨基酸，與促細胞分裂有關(guān)。
類胰島素生長因子：能與細胞表達的胰島素受體結(jié)合，從而有胰島素同樣的作用。
促生長**：促細胞增殖效應(yīng)。
氫化可的松：血清中含有定量的該成分，它可能兼有促細胞貼附和增殖作用，但有人證明，血清中的氫化可的松
，如細胞密度高時可能有抑制細胞的作用和誘導(dǎo)其發(fā)生分化。

4其他成份
氨基酸、葡萄糖、酮酸等對多種營養(yǎng)成分的合成培養(yǎng)基意義不大。與蛋白相結(jié)合狀態(tài)的微量元素對細胞培養(yǎng)有意
義。

三、 牛血清的質(zhì)量要求
隨著科學技術(shù)的發(fā)展和生活水平的不斷提高對生物醫(yī)藥產(chǎn)品的質(zhì)量要求也越來越高，所以對制備工藝中所涉及到
的各種原材料的質(zhì)量標準要求也越來越高，特別是對用于細胞培養(yǎng)基中的主要天然成份――牛血清的質(zhì)量要求也
不斷提高。牛血清包括胎牛血清、新生牛血清和成牛血清。

（一）、WHO公布的《用動物細胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求：

1. 牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應(yīng)具備適當?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng)。

2.有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

3.證明所用牛血清中不含對所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。

4.血清要通過濾膜過濾**，保證無菌。

5.無**、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無**噬菌體污染。

6.對細胞有良好的支持繁殖作用。

（二）、我國在對牛血清的質(zhì)量2000年版《生物制品主要原輔料質(zhì)控標準》中提出比較嚴格的標準要求。包
括蛋白質(zhì)含量，**、**、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、**內(nèi)**，支持細胞增殖檢查。

（三）、美國對牛血清的質(zhì)量要求：Gibco 和Sigma二家主要的美國牛血清供應(yīng)商的牛血清都已進入到我國市場，
他們對其質(zhì)量標準要求都極為嚴格，從血清來源到產(chǎn)品質(zhì)量都有明確規(guī)定。

1） 血清來源：可從世界各國收集胎牛血清，但是必須符合他的質(zhì)量標準和美國農(nóng)業(yè)部進口要求。地方當局還不
清楚本地是否有牛海綿狀病毒流行的血清不收集，有說明血清質(zhì)量的證明資料：包括收集過程的全部資料、檢驗
結(jié)果和交付情況。

2）血清的收集：胎牛血清是心臟穿刺取血，新生牛（10～14天）和小牛（10個月內(nèi)）血清靜脈取血。血清采集條
件必須符合工業(yè)生產(chǎn)的標準：低溫下采集、一次分離、分離后立即混合凍存。符合要求的血清56℃水浴30分鐘滅
活。

3）血清的制備：
a.超低IgG胎牛血清：通過親和層析工藝去除胎牛血清中的γ球蛋白，使FBSγ球蛋白含量減到*低，一般IgG≤5ug/ml，生物學活性不變。

b. 血清透析：用12000～14000分子量的透析膜在0.15MNaCl中透析直到使葡萄糖含量＜0.5mg/ml（用葡萄糖氧
化酶／過氧化酶方法測定）。

c. γ－射線照射：已經(jīng)證明γ－射線照射可以有效滅**清中可能污染的病毒、支原體。照射劑量為30～45KG。
而且這個劑量的γ－射線照射不會改變血清的理化性質(zhì)和對細胞培養(yǎng)的影響。

4）**過濾:經(jīng)過上述處理的粗制血清再經(jīng)過一系列**濾膜過濾包括0.2微米（micron）和0.1微米濾膜。FBS要
通過三層0.1微米濾膜，其他血清可通過0.2微米濾膜。

4.終產(chǎn)品血清質(zhì)量

1）化學檢定：滲透壓
pH
蛋白含量――電泳法
白蛋白 球蛋白 血紅蛋白
隨著牛年齡增加血清中總蛋白含量相應(yīng)增加，總的血清蛋白含量可以確定產(chǎn)品規(guī)格和年齡。
2） 微生物學檢查：**、**符合USP標準。
支原體：在支原體專業(yè)培養(yǎng)基上培養(yǎng)了3～4周，培養(yǎng)溫度36℃±2℃
分別在需氧和厭氧條件下進行，有的還需要在支原體瓊脂培養(yǎng)皿上傳4次，Hoechst熒光素DNA染色檢查那些培養(yǎng)法
無法檢出的支原體如豬鼻支原體等。

病毒檢查：
牛蘭舌病毒 Bovin blue tongue
牛腺病毒 Bovine Adenovirus
牛細小病毒 Bovine Parvovirus
牛病毒性腹泄病毒 Bovine Viral Diarhea Virus
狂犬病病毒 Rabies
呼腸弧病毒 Reovirus
牛呼吸道合胞病毒 BRSV
副流感病毒Ⅲ型 Parainfluenza

檢查方法：
已證明無外源因子污染的牛細胞培養(yǎng)物，在細胞生長液中加15％待測血清，連傳3代共21天。陰性對照細胞培養(yǎng)液
中加15％已知無病毒污染的牛血清，與試驗組同條件下進行。在觀察期內(nèi)注意細胞形態(tài)變化或細胞病變。在觀察
期內(nèi)第14天待檢樣品和對照樣品用標準病毒檢測方法檢查。

如待檢細胞培養(yǎng)物經(jīng)胰酶消化后分種到6個含蓋玻片的容器內(nèi)。陰性對照樣品按同樣方法。再將牛腹泄病毒、牛細
小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼腸弧病毒分別加入待檢培養(yǎng)物蓋玻片容器內(nèi)作為陽性對照，再培養(yǎng)7天，用熒光
抗體技術(shù)進行檢查。

細胞病變或病毒引起的其他改變通過蘇木精或伊紅染色進行觀察。取另外一個待檢細胞培養(yǎng)瓶用人“O”紅細胞、
豚鼠紅細胞和新鮮雞紅細胞作血球吸附病毒檢查。試驗在2～8℃和20～24℃進行。陰性對照細胞預(yù)先感染副流感
Ⅲ型病毒作為陽性對照。未感染的細胞作為陰性對照。

3）內(nèi)**檢測
用鱟試劑檢查。

4）**噬菌體檢查
主要檢查E.Coli(C300 or K-12)噬菌體。

5）**含量測定
每批FBS對某些**含量都要進行測定，包括：雌二醇、胰島素、孕硐、睪丸素、甲狀腺素等。

6）血紅蛋白檢測
血紅蛋白與氧合血紅蛋白的比≥70％，血紅蛋白含量≤mg15/dl。

7）細胞生長效果測定
a.細胞克隆效果測定
細胞選擇：Sp20/Ag-14 或P3X63-Ag8.653
血清濃度與細胞數(shù):
10％血清／1個細胞／孔
4％血清／5個細胞／孔
細胞培養(yǎng)基RPMI－1640， 96孔培養(yǎng)盤36℃±2℃，5％二氧化碳培養(yǎng)10～
15天。試驗中選擇一個已知參考牛血清作對照。
克隆效率計算：
克隆效率＝(陽性孔平均數(shù)/ 培養(yǎng)孔總數(shù)) X100％

相對克隆效率＝待測血清克隆效率/參考血清克隆效率

b.貼壁效率試驗：
用人的傳代細胞作每批血清的貼壁效率試驗，A549（人肺癌細胞）該細胞可以反應(yīng)出低濃度血清的貼壁變化。采
用6孔培養(yǎng)盤每批血清用兩種濃度和兩種不同的細胞接種數(shù)即10％血清――100細胞／孔，4％血清200介細胞／孔
。放36℃±2℃，濕潤5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～14天，計算著色細胞克隆，確定貼壁效率。從這兩種不同血清
濃度來確立實驗血清支持細胞貼壁生長的水平，分析兩種試驗條件下平均貼壁效率。

貼壁效率（％）＝(每孔克隆平均數(shù)/ 每孔活存的培養(yǎng)細胞平均數(shù)) X100％

相對貼壁效率＝被測血清貼壁效率/參考血清貼壁效率
c. 二倍體纖維細胞促生長試驗
人二倍體細胞株 WI28 MRc5

25cm2細胞培養(yǎng)瓶，5％血清，每瓶接種1.5X105細胞連傳3代，每代血清濃度和接種細胞數(shù)相同，每代培養(yǎng)7天，每
代接種二個細胞瓶，36℃±2℃培養(yǎng)。以同樣條件用已知參考血清進行平行培養(yǎng)。每代收獲細胞計數(shù)，計算每批待
檢血清與參考血清的相對生長率（RGR）。

RGR＝(試驗血清每瓶細胞平均數(shù)/ 參考血清每瓶細胞平均數(shù)) X100％

牛血清主要質(zhì)量要求（Sigma）

胎牛血清 新生牛血清 成牛血清
牛齡 胎 10～14天 ＜10個月
無菌 － － －
病毒 － － －
支原體 － － －
噬菌體 － － －
內(nèi)**（ng/ml） ≤1.0 ≤10.0 ≤10(15)
血紅蛋白（g%） 3.0～4.5 3.5～6.0 5.0～8.5
pH 6.7～8.0 7.0～8.0 7.0～8.0
滲透壓（mom/Kg H2O） 240～340 240～340 240～340


新的藥品管理法即將公布，新的藥品管理法對生物制品提出更嚴格的質(zhì)量要求。特別是我國即將加入WTO，會有更多的國外生物制品進入市場，我國的生物制品也希望更多地走向國際市場，所以在制品質(zhì)量上要求會更高，產(chǎn)品的市場競爭應(yīng)主要靠質(zhì)量競爭。所以對產(chǎn)品中的主要原材料的質(zhì)量要求也會越來越嚴格。如實驗動物我國SDA已提出嚴格的質(zhì)量標準，并提出國內(nèi)各使用部門達到標準的期限。為了貫徹2000年版《生物制品規(guī)程》標委會修訂了《生物制品主要原輔材料質(zhì)控標準》其中包括了生產(chǎn)用牛血清的質(zhì)控要求，這是一個*低要求，和國外產(chǎn)品的要求還有差距，希望各牛血清生產(chǎn)單位和使用單位，自己能制定出更高更嚴格的標準，以進一步提高我國生物制品質(zhì)量。
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