特征性研究：內(nèi)源性GPCRs 細(xì)胞功能圖研究
前言
G-偶聯(lián)蛋白受體（GPCRs），即7-跨膜蛋白，是當(dāng)今臨床與科研**的單一**靶點(diǎn)，也是迄今發(fā)現(xiàn)*大的靶點(diǎn)家族。據(jù)推測人基因組中，該家族的功能成員超過300個，涉及多種不同細(xì)胞與組織間的廣泛信號途徑。研究證實(shí)，對GPCR功能的調(diào)節(jié)，有助于**學(xué)、神經(jīng)病學(xué)、心臟病學(xué)與腫瘤學(xué)領(lǐng)域多種**的**。
通過應(yīng)用新的基于細(xì)胞水平的受體功能檢測技術(shù)，候選**對新調(diào)節(jié)子的確認(rèn)率顯著提高，損耗率（定義為臨床前檢測/臨床試驗(yàn)失敗率）降低。但基礎(chǔ)研究獲得的GPCR功能數(shù)據(jù)很難被應(yīng)用于臨床**中。造成這種情況的原因是，傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)往往（1）使用異源細(xì)胞，或相關(guān)性較低的細(xì)胞類型，進(jìn)行人造受體的過表達(dá)；（2）使用外源性檢測試劑，如熒光標(biāo)記試劑；（3）使用侵入性處理手段，像染料負(fù)載以及細(xì)胞裂解，（4）生成的數(shù)據(jù)僅為單一時間點(diǎn)的數(shù)據(jù)，而不是持續(xù)性細(xì)胞監(jiān)測數(shù)據(jù)。
*近開發(fā)的生物相關(guān)性程度更高的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，可顯著改善GPCR**開發(fā)與研究應(yīng)用的成功率(1)。羅氏應(yīng)用科學(xué)部的xCELLigence系統(tǒng)，不需要使用外源性標(biāo)記，即可對**相關(guān)細(xì)胞的內(nèi)源性GPCR功能進(jìn)行實(shí)時評測。將細(xì)胞接種于含有微電極的培養(yǎng)板上，可對GPCR激活導(dǎo)致的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的微小變化與細(xì)胞收縮情況進(jìn)行準(zhǔn)確測定。
通過與細(xì)胞漿鳥嘌呤核苷結(jié)合蛋白或 G 蛋白結(jié)合偶聯(lián)，GPCRs 可進(jìn)行細(xì)胞的信號傳導(dǎo)活動。所有主要的與G蛋白偶聯(lián)的**信使通路，都已被發(fā)現(xiàn)會激活環(huán)化AMP/蛋白激酶 A、鈣離子/磷酸酶 C、β-抑制蛋白/MAPK，以及 Rho家族GTP酶，使細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變。而xCELLigence系統(tǒng)可通過記錄細(xì)胞阻抗，很容易對形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行檢測(2)，從而完成對GPCR的檢測。
與傳統(tǒng)檢測方法相比，形態(tài)學(xué)阻抗測定可對多個信號途徑累積效應(yīng)進(jìn)行捕獲。內(nèi)源性GPCR功能測定的優(yōu)勢包括（1）對靶受體進(jìn)行評價是在其正常表達(dá)水平上；（2）在調(diào)節(jié)因子包括**或異源性二聚體存在情況下，對受體之間的天然相互作用情況進(jìn)行分析；（3）允許GPCR與細(xì)胞內(nèi) G蛋白的天然偶聯(lián)。同時，應(yīng)用實(shí)時無標(biāo)記xCELLigence檢測系統(tǒng)，可動態(tài)實(shí)時地記錄實(shí)驗(yàn)期間的所有阻抗信息，從而對所有GPCR的反應(yīng)進(jìn)行檢測。通過單一檢測即可對GPCR激活導(dǎo)致的所有**信使途徑進(jìn)行測定，從而有效降低試劑成本。
本研究中，我們發(fā)現(xiàn) xCELLigence 系統(tǒng)是一種靈敏的、可靠的檢測系統(tǒng)，用于持續(xù)內(nèi)源性 GPCR功能測定。研究中我們對涉及24 個**相關(guān)受體家族的一組 43個配體（參見表1）進(jìn)行了測定，并生成了相關(guān)GPCR功能圖譜。實(shí)驗(yàn)涉及通用的腫瘤細(xì)胞系、HeLa、U2OS、SH-SY5Y與CHO-K1，以及**相關(guān)的原代細(xì)胞：人血管內(nèi)皮細(xì)胞與混合腎上皮細(xì)胞。
表 1：GPCR 功能圖概述
材料與方法
細(xì)胞系與培養(yǎng)條件：細(xì)胞系來自于ATCC。按照 ATCC的建議進(jìn)行HeLa（#CCL-2）、U2OS（#HTB-96）、SH-SY5Y（#CRL-2266）、CHO-K1（#CCL-61）、人血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC；#PCS-100-010 批號58570370）與混合腎原代上皮細(xì)胞（MREC；ATCC # PCS-400-012 lot#58488854）的培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞系傳代至 10 代以上，原代細(xì)胞系傳代至 4 代。
檢測程序：所有檢測均于組織培養(yǎng)器（5% CO2，37°C ）中進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)基為生長培養(yǎng)基，細(xì)胞接種密度是 1-2 x104細(xì)胞每孔，接種于96孔E-Plates中，并通過xCELLigence系統(tǒng)進(jìn)行過夜監(jiān)測，直至細(xì)胞生長至接近滿板，復(fù)孔檢測。預(yù)先在另一普通96孔板中每孔中添加 2 μl**，并儲存于 -20℃。待細(xì)胞培養(yǎng)18-24 小時后，進(jìn)行**稀釋反應(yīng)。將**融解，并添加 132 μl 檢測緩沖液（1 xHBSS，Sigma H8264、20mMHEPES，Cellgro 25-060-Cl、0.1% BSA，F(xiàn)isherScientific#BP1600）對其進(jìn)行稀釋處理。從培養(yǎng)箱中移除 E-Plates96，使用檢測緩沖液進(jìn)行洗滌，洗滌一次，并使用BiotekMicroFlo Select，于每孔中添加 140 μl 檢測緩沖液。將E-Plates 96 放回至RTCA MP 站，放置15分鐘，進(jìn)行細(xì)胞平衡。然后使用 Beckman Multimek96，同時在各孔添加10μl的**緩沖液。小分子**實(shí)驗(yàn)*終濃度為10μM，多肽為1μM。
數(shù)據(jù)分析：使用RTCA軟件，對每孔的數(shù)據(jù)在**添加前時間點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。對于各種**，在計算時需減去只含**溶劑時對照細(xì)胞表現(xiàn)出的背景值。小分子**相應(yīng)溶劑為DMSO，多肽**相應(yīng)溶劑為0.1%的BSA。
將檢測結(jié)果數(shù)據(jù)導(dǎo)出至MicrosoftExcel，進(jìn)行后續(xù)計算。確定每孔細(xì)胞的*大與*小細(xì)胞指數(shù)值，計算重復(fù)檢測（n=2）的均值標(biāo)準(zhǔn)差與平均值。對于對照孔細(xì)胞來說，對重復(fù)檢測8個孔的均值標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行測定。將這些數(shù)值平均并乘以 3 以計算"hit"閾值。對于 Z 因子與EC50計算來說，使用RTCA MP提供的動態(tài)反應(yīng)曲線，選擇一時間點(diǎn)作為細(xì)胞系及**綜合反應(yīng)的*佳時間點(diǎn)。
結(jié)果
為確保研究的重現(xiàn)性，細(xì)胞為可靠來源，并可確保細(xì)胞的質(zhì)量與類別。所有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均來自于美國細(xì)胞菌種庫（ATCC）。檢測前，進(jìn)行有限傳代，按照ATCC的建議進(jìn)行細(xì)胞的保存。
內(nèi)源性GPCR檢測穩(wěn)定性。檢測各種條件下HeLa細(xì)胞對內(nèi)源性GPCRs激活劑的反應(yīng)性。且將鈣離子載體A23187作為陽性對照，并對其進(jìn)行檢測。低濃度情況下，由于Gq-偶聯(lián)GPCR的激活，A23187可模擬鈣離子的活化過程。由于其獨(dú)立于GPCRs的表達(dá)，這種反應(yīng)有助于細(xì)胞檢測條件的研發(fā)。*強(qiáng)烈反應(yīng)出現(xiàn)于過夜長滿平板的細(xì)胞。此時使用GPCR檢測通用緩沖液更換掉生長培養(yǎng)基（參見詳細(xì)檢測條件中的材料與方法）。
按照這些檢測條件對幾種不同細(xì)胞系對 A23187 與1-磷酸鞘氨醇（SIP）的反應(yīng)進(jìn)行評價，SIP 是無所不在的GPCR表達(dá)家族、溶血磷脂或內(nèi)皮分化基因（EDG）受體的內(nèi)源性激活劑。Z量測因子考慮有信噪比與檢測的變異性，用于對檢測強(qiáng)度進(jìn)行評價(3)。使用終濃度1μM 或與緩沖試劑（0.1% BSA）相同濃度的 S1P 與 終濃度 100 nM或與其緩沖試劑（DMSO）相同濃度的A23187 對 8 個重復(fù)多孔培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行處理。使用xCELLigence系統(tǒng)，對細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，間隔時間1分鐘。
激活劑添加后*初幾分鐘期間，即開始檢測細(xì)胞反應(yīng)。每種細(xì)胞系中，添加激活劑后的*初 30-40分鐘期間細(xì)胞反應(yīng)*大（參見圖1）。如圖所示，處理后接近 30 分鐘時，HeLa 細(xì)胞對A23187 的反應(yīng)*大，對S1P的反應(yīng)接近*大。此時，A23187 與S1P 的 Z 因子分別是0.83與 0.90。所檢測的細(xì)胞類型中，兩種處理中至少一種Z因子分值超出0.5，表明檢測可靠性高（參見表 2）。相反，兩種配體混合的原代腎上皮細(xì)胞（RMEC） Z因子接近0.25，表明檢測可靠性不顯著。但后續(xù) GPCR 篩查檢測結(jié)果表明，該細(xì)胞類型其他 GPCRs 可靠性更高。
圖 1：GPCR 檢測可靠性評價。HeLa 細(xì)胞接種密度是 10000 細(xì)胞每孔，接種于E-Plate96上，放置于xCELLigence RTCA MP 儀器，并在培養(yǎng)箱中過夜。然后去除生長培養(yǎng)基，添加檢測緩沖液，持續(xù)細(xì)胞監(jiān)測15分鐘后，添加 GPCR調(diào)節(jié)**，記錄每分鐘細(xì)胞反應(yīng)情況，記錄1.5小時。獲得時間依賴性細(xì)胞反應(yīng)曲線。八復(fù)孔，誤差列代表均值標(biāo)準(zhǔn)差。**添加后 30 分鐘，計算單一時間點(diǎn) Z因子值檢測質(zhì)量。DMSO是 A23187 試劑對照；0.1% BSA 用于 S1P。SD = 標(biāo)準(zhǔn)差；ABS = **值。
圖 2：GPCR 檢測靈敏性評價。如圖 1 方法，對 HeLa 細(xì)胞進(jìn)行檢測，每種**以8個濃度處理細(xì)胞。使用RTCA軟件，通過計算**添加30分鐘后每種**的EC50值，對檢測靈敏性進(jìn)行測定。
內(nèi)源性GPCR檢測靈敏性。我們也使用 A23187 與 S1P，以及 8 點(diǎn)劑量反應(yīng)曲線檢測實(shí)驗(yàn)靈敏性（參見圖 2）。于Z因子測定相同時間點(diǎn)，通過 RTCA 軟件計算產(chǎn)生 50% *大反應(yīng)（EC50 值）的激活劑濃度。
每種細(xì)胞系的 EC50 值見表 2。每種細(xì)胞對A23187的處理均比較敏感，除CHO-K1外，所有細(xì)胞類型對 S1P 的處理均非常敏感，產(chǎn)生的 EC50值低限為10-7 至 10-9。盡管 CHO-K1 細(xì)胞表達(dá)EDG受體(4)，后續(xù)檢測S1P與溶血磷脂酸（LPA）反應(yīng)分值為陽性（見下文），但是為生成準(zhǔn)確的EC50，很明顯，這里所用的劑量不足以飽和生物反應(yīng)。
內(nèi)源性GPCR功能圖。優(yōu)化檢測參數(shù)后，使用**相關(guān) GPCRs 的一組43個小分子與多肽調(diào)節(jié)子，對本研究中所用的細(xì)胞類型的功能反應(yīng)進(jìn)行檢測（參見表 1）。該組**指向的24個受體家族，包括50種潛在性反應(yīng)受體，代表所有主要的GPCR偶聯(lián)類型（Gs、Gi、Gq、G12/13）。使用上文程序進(jìn)行復(fù)孔檢測各細(xì)胞類型。
表 2：檢測開發(fā)與評價概述
四種腫瘤細(xì)胞系HeLa、CHO-K1、U2OS 與SH-SY5Y對每種**都會生成獨(dú)特的時間依賴性細(xì)胞曲線（time-dependent cellularresponseprofile，TCRP）（數(shù)據(jù)未顯示）。我們對每孔*大與*小細(xì)胞指數(shù)值進(jìn)行測定，該指數(shù)值與時間點(diǎn)無關(guān)，并以該數(shù)值均值與標(biāo)準(zhǔn)差作圖（參見圖3）。GPCR功能圖表明，對能引發(fā)反應(yīng)的配體而言，細(xì)胞指數(shù)值的增加或降低具有顯著差異。例如，HeLa細(xì)胞顯示的細(xì)胞指數(shù)正向改變程度較大，CHO-K1細(xì)胞顯示的細(xì)胞指數(shù)負(fù)向改變程度較大，包括同樣受體家族中的 GPCRs，如PGE1、2與 Iloprost 激活前列腺素類受體（參見圖3）。這些結(jié)果表明，細(xì)胞背景差異可顯著改變對同樣刺激物的形態(tài)學(xué)反應(yīng)，這可能是由于G蛋白偶聯(lián)的差異，或下游信號傳導(dǎo)途徑的差異，這些差異可使細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變。細(xì)胞指數(shù)值的總體模式同樣也可反映出不同GPCR配體的相對特異性。SDF1a，即 CXCR4 內(nèi)源性激活劑，僅可于HeLa細(xì)胞中，誘導(dǎo)出強(qiáng)大的正向細(xì)胞指數(shù)反應(yīng)，而降鈣素僅可誘導(dǎo)出CHO-K1細(xì)胞的強(qiáng)大的負(fù)向細(xì)胞指數(shù)反應(yīng)。我們也對兩種附加腫瘤細(xì)胞系：SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤與U2OS骨肉瘤細(xì)胞，以及兩種原代細(xì)胞類型：人血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）與混合原代腎上皮細(xì)胞（這里簡稱MREC）的 GPCR配體進(jìn)行檢測。
為測定細(xì)胞系的相應(yīng)活性配體，我們將8個對照孔的*大與*小細(xì)胞指數(shù)反應(yīng)值與固有變異性進(jìn)行比較。細(xì)胞指數(shù)值超出或低于對照孔細(xì)胞檢測值的三個標(biāo)準(zhǔn)差的檢測孔細(xì)胞被視為呈活性反應(yīng)。配體誘導(dǎo)活性反應(yīng)見圖3與4。每種細(xì)胞相應(yīng)內(nèi)源性 GPCR 見表 1。
一種或更多細(xì)胞類型中，有14種受體家族被確認(rèn)為活性反應(yīng)。多種情況下，本研究中使用的內(nèi)源性配體可激活同樣受體家族的多個成員。例如，血清素可激活所有內(nèi)源性血清素受體，包括幾種亞家族，其中幾種亞家族具有多種亞型?？傊?，研究證實(shí)，對一種或更多的腫瘤細(xì)胞，以及本研究所用的原代細(xì)胞中，xCELLigence系統(tǒng)細(xì)胞指數(shù)圖是一種可靠的方式，可用于對14種不同 GPCR 家族進(jìn)行功能檢測。
圖 3：腫瘤細(xì)胞系 GPCR 功能圖。指定類型細(xì)胞的檢測如圖 1所示，于反應(yīng)板單孔中，對細(xì)胞添43個GPCR調(diào)節(jié)**后的反應(yīng)進(jìn)行評價，并進(jìn)行復(fù)孔重復(fù)。測定每孔*大與*小的細(xì)胞指數(shù)值（參見材料與方法）。使用RTCA軟件，減去每時間點(diǎn)緩沖液對照孔的平均基線細(xì)胞指數(shù)值，從而對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理（參見詳細(xì)文本說明）。因此對照孔細(xì)胞指數(shù)值為零。誤差列代表監(jiān)測時間窗內(nèi)培養(yǎng)孔的標(biāo)準(zhǔn)差。以反應(yīng)孔的處理細(xì)胞的重復(fù)多個細(xì)胞指數(shù)值（兩個重復(fù)多個反應(yīng)板，n=2）均值作圖。誤差列代表重復(fù)多個細(xì)胞指數(shù)值的一個標(biāo)準(zhǔn)差。紅色虛線代表對照孔的3倍標(biāo)準(zhǔn)差。明確導(dǎo)致細(xì)胞指數(shù)值增加（綠色線）或降低（紅色線）的**以實(shí)線框加強(qiáng)；無顯著統(tǒng)計學(xué)意義的數(shù)據(jù)（低于3倍標(biāo)準(zhǔn)差-臨界值）以虛線框顯示。
圖 4：原代細(xì)胞 GPCR 功能圖。如圖 3 所示，對指定細(xì)胞類型的原代細(xì)胞進(jìn)行檢測。
討論
xCELLigence系統(tǒng)的實(shí)時無標(biāo)記細(xì)胞檢測技術(shù)可加速**開發(fā)進(jìn)程，并使基礎(chǔ)研究成果更快的應(yīng)用至臨床中。我們的研究顯示，通過xCELLigence系統(tǒng)，可對腫瘤細(xì)胞系與原代細(xì)胞的 GPCRs功能進(jìn)行檢測。目前研究顯示，一種或更多的細(xì)胞系中，檢測的大多數(shù)受體靶GPCR家族可產(chǎn)生穩(wěn)定反應(yīng)，反應(yīng)強(qiáng)度高于對照孔細(xì)胞均值的三倍標(biāo)準(zhǔn)差。以同樣方式對多種細(xì)胞類型進(jìn)行檢測，除本文列出外，還可發(fā)現(xiàn)更多的內(nèi)源性GPCR檢測數(shù)量。已檢測的部分配體可激活GPCR家族多個成員。通過所選基因表達(dá)圖的激動劑與拮抗劑附加實(shí)驗(yàn)，以及單一受體siRNA敲除檢測，可對xCELLigence系統(tǒng)檢測到的，引發(fā)形態(tài)學(xué)改變的特異性受體亞型進(jìn)行確認(rèn)。
結(jié)論
o xCELLigence 系統(tǒng)可對廣泛的內(nèi)源性 GPCRs 功能進(jìn)行檢測。
o xCELLigence 系統(tǒng)進(jìn)行的GPCR 檢測，靈敏性與穩(wěn)定性非常高。
o xCELLigence 系統(tǒng)進(jìn)行的GPCR 檢測GPCR 檢測，可用于癌細(xì)胞系與原代培養(yǎng)細(xì)胞系。
