一、材料及試劑

1、豬瘟單抗純化抗原

2、兔抗豬IgG酶標(biāo)抗體

3、豬瘟陽(yáng)性血清

4、豬瘟陰性血清

1～4均由指定的生物制品所購(gòu)買(mǎi)。

5、ELISA反應(yīng)板

6、包被液

碳酸鈉 1.50g

碳酸氫鈉 2.93g

H2O加至 1 000ml

pH值9.6

7、PBS液

氯化鈉 8.90g

磷酸二氫鉀 0.20g

無(wú)水磷酸氫二鈉 2.13g

加雙餾水 1 000ml

8、PBS－吐溫洗滌液

PBS液 1 000ml

犢牛血清 5ml

混合即可

9、底物溶液

⑴ 0.1Mol/L檸檬酸液

檸檬酸 21g

雙蒸餾水加至 1 000ml

⑵ 0.2Mol/L Na2HPO4液

Na2HPO4·12H2O 71.6g

雙蒸餾水 加至 1 000ml

⑶ pH5.0磷酸鹽－檸檬酸緩沖液

取⑴液 24.30ml

⑵液 25.70ml

混勻即可

⑷鄰苯二胺液

?、且?50ml

雙餾水 50ml

磷苯二胺 20mg

30%H2O2 0.15ml

待鄰苯二胺溶化后再加H2O2，現(xiàn)用現(xiàn)配。

10、終止液

濃H2SO4(98%) 22.2ml

H2O 177.80ml

二、操作方法

1、用包被液將豬瘟弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原、豬瘟強(qiáng)毒單抗純化酶聯(lián)抗原各做100倍稀釋?zhuān)靠装?00μl，4℃濕盒過(guò)夜。

2、次日取出，甩去孔內(nèi)液體，3×3′沖洗。

3、將待檢血清以PBS液做400倍稀釋?zhuān)靠准?00μl同時(shí)將豬瘟陽(yáng)性血清、豬瘟陰性血清各做100倍稀釋?zhuān)趯?duì)照孔中加100μl.37℃溫育1.5h～2h。

4、重復(fù)**步，取出，甩去孔內(nèi)液體，3×3′洗滌。

5、將兔抗豬IgG酶標(biāo)抗體以PBS液做100倍稀釋?zhuān)靠准?00μl，37℃溫育1.5h～2h。

6、重復(fù)第4步。

7、每孔加底物溶液100μl，室溫下觀察顯色反應(yīng)。當(dāng)陰性對(duì)照孔稍顯色時(shí)，立即終止反應(yīng)，并以陰性孔做空白對(duì)照。

8、每孔加終止液50μl立即于酶聯(lián)**吸附檢測(cè)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)的光密度。

三、結(jié)果判定

在豬瘟弱毒酶聯(lián)板上，OD≥0.2，為豬瘟弱毒抗體陽(yáng)性；OD＜0.2，為豬瘟弱毒抗體陰性。

在豬瘟強(qiáng)毒酶聯(lián)板上，OD≥0.5，為豬瘟強(qiáng)毒抗體陽(yáng)性；OD＜0.2，為豬瘟強(qiáng)毒抗體陰性。