簡介：克倫特羅（Clenbuterol）屬于beta興奮劑，是一種高選擇性的興奮劑和**，具有水解脂肪、合成代謝和對非條紋肌肉組織的松弛作用。進(jìn)年來被一些人非法添加到飼料中以提高脂肪型動物的瘦肉率和加速動物的生長。當(dāng)用作生長調(diào)節(jié)劑時，其添加量是**量的5—10倍，常在動物體內(nèi)殘留而給消費者帶來危害。

通常，HPLC或GC-MS是克倫特羅殘留檢測的確證方法，但是其前處理步驟費用昂貴，而ELISA快速檢測試劑盒因成本低、操作簡便、速度快、一次檢測樣本量大、儀器化低，現(xiàn)已成為常規(guī)的篩選方法。

一、檢測原理

測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板上包被有針對兔IgG（Clenbuterol抗體）的羊抗體，含有克倫特羅抗原的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)記物被加入到小孔中，經(jīng)過孵育及洗滌步驟后，游離的抗原與抗原酶標(biāo)記物競爭抗體結(jié)合位點，沒有結(jié)合的抗原酶標(biāo)記物在清洗步驟中被除去，將顯色液加入到孔中并且孵育，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色。在450nm處測量，吸光強度與樣品的克倫特羅濃度成反比。

二、操作時間

1小時(30分鐘孵育 30分鐘顯色)

三、檢測下限

0.1ppb

四、回收率

尿樣和血清： 97-110%

飼料： 95-100%

肝臟/組織： 90-97%

牛奶及奶粉 100%

五、交叉反應(yīng)率

Clenbuterol (克倫特羅) 100%

Mabuterol（馬普特羅） 100%

Mapenterol（馬噴特羅） 100%

Salbutamal (沙丁胺醇) 8-9%

Terbutalin (特普他林) 7-8%

Simarterol(塞曼特羅) <0.1%

Isoproterenol（異丙腎上腺素） <0.1%

Fenoterol（非諾特羅） <0.1%

六、試劑盒的組成

1、 96孔酶標(biāo)板：12條╳8孔（包被有抗兔IgG）。

2、克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液6瓶：1ml /瓶，為Clenbuterol水溶液:0.1ng/ml，0.3 ng/ml，0.6ng/ml，1.25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml.

3、酶聯(lián)結(jié)合物Conjugate peroxidase： 6ml 黃蓋

4、 抗Clenbuterol抗體溶液：Anti-clenbuterol antibody 11ml 紅蓋

5、沖洗液（需10倍稀釋）Wash buffer： 50ml 塑料瓶

6、檸檬酸鹽緩沖液Citrate buffer： 25ml 藍(lán)蓋

7、底物溶液Chromogen： 3 ml 黑蓋

8、樣品稀釋液（需20倍稀釋）Diluent solution: 10ml 綠蓋

9、反應(yīng)終止液Stop solution： 6ml 白蓋

七、需要設(shè)備及試劑（試劑盒中未提供）

設(shè)備：

1、 均質(zhì)器

2、 振蕩器

3、微孔酶標(biāo)儀（450nm）

4、離心機

5、20ul，50ul，100ul，200ul微量加樣器

6、**親和柱（每根柱子可以至少可以純化120-150個樣本，也可以用C18柱純化）。

試劑：

1、氫氧化鈉

2、0.01M HCL

3、5M鹽酸

4、蒸餾水

八、工作液的準(zhǔn)備

1、洗液：用蒸餾水按（1 9）稀釋

2、樣品稀釋液：將樣品稀釋液用蒸餾水按（1 19）稀釋（注：在使用前再配）。

3、底物溶液：用檸檬酸緩沖液（1 9）稀釋（注：檸檬酸緩沖液本試劑盒內(nèi)有提供，稀釋后的溶液避免光線直射）。

注：終止液含硫酸，要小心操作。

九、樣品前處理

1、尿液和血清：（稀釋因子1）

尿液和血清不用處理，直接測定。（如果尿液渾濁，一定要過濾或離心）

2、肝臟

2.1（簡便前處理方法）（稀釋因子3）

1） 取1g肝臟樣品，加入2ml0.01M HCL.

2） 均質(zhì)5分鐘。

3） 檢查pH值是否在6.5-8之間，否則用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)。

4） 離心15分鐘3500rpm，或者離心5分鐘13000rpm，轉(zhuǎn)移出上清液備用。

2.2.（復(fù)雜前處理方法）（稀釋因子1）

1） 帶有低脂肪的肝，肉或組織。

2） 5g粉碎的樣品于25ml 50mM 鹽酸混合，振蕩15分鐘，以達(dá)到均質(zhì)的目的。

3） 稱6g均質(zhì)物（相當(dāng)于1g肝臟），加入離心瓶中。

4） 10—15℃離心15分鐘4000rpm或更高的轉(zhuǎn)速。

5） 轉(zhuǎn)移出上清液至另一個離心瓶中，加300ul 1M 氫氧化鈉混合15分鐘。

6） 加入4ml 500mM 磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0，簡單混合并在4℃保存至少1.5小時或過夜

7） 在10-15℃離心15分鐘，4000g或更高轉(zhuǎn)速。

8） 分離全部上清液（應(yīng)該是清亮的），使其升至室溫（20-24℃），然后用C18柱純化（見C18柱純化步驟）。

9） C18柱純化方法：

所有試劑和樣品處理必須在室溫下（20-24℃）并嚴(yán)格控制過柱時的流速。（非常關(guān)鍵）

①用3ml100%甲醇洗滌柱子，流速為1滴/秒。

②用2ml洗滌液洗滌柱子（50mM磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0）。

③樣品進(jìn)柱。

④用2ml洗滌液洗滌柱子（50mM磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0）。

⑤用正壓去除殘留的液體并用空氣或氮氣吹2分鐘干燥柱子。

⑥用1ml100%甲醇洗脫樣品，流速為15滴/分鐘。

⑦在50-60℃弱空氣或氮氣流下完全蒸發(fā)溶劑。

⑧用1ml蒸餾水溶解干燥的殘留物，備用分析。

3、飼料（稀釋因子10）：

1) 用乳缽研碎飼料，稱1g研碎的飼料樣品加入10ml0.01M的鹽酸，充分混合5分鐘。

2) 檢查pH值是否在6.5-8之間，否則用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)

3) 離心5分鐘3500rpm，轉(zhuǎn)移出上清液。（如上清液仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過濾）