**測定（immunoassay，IA）是利用抗原抗體反應(yīng)檢測標(biāo)本中微量物質(zhì)的方法。基于抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性，**測定的應(yīng)用范圍遍及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的各個(gè)領(lǐng)域。任何物質(zhì)只要能獲得相應(yīng)的特異性抗體，即可用**測定進(jìn)行檢測?？蓽y定的對(duì)象包括：具有**活性的**球蛋白、補(bǔ)體、細(xì)胞因子等；微生物的抗原和相應(yīng)的抗體；血液凝固因子；以及臨床化學(xué)測定中微量而難于分離的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、同工酶、**、**、毒品等。

由于**測定在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的地位日益重要，近年來新方法、新技術(shù)不斷出現(xiàn)。從總體上說，其進(jìn)展主要在自動(dòng)化和簡便化兩個(gè)方面。

一、 **測定自動(dòng)化^{[1，2，3]}

隨著檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，檢測項(xiàng)目和標(biāo)本量急劇增加，在大型實(shí)驗(yàn)室中自動(dòng)化系統(tǒng)取代手工操作是必然的趨勢。20世紀(jì)50年代生化自動(dòng)分析儀即取得實(shí)際應(yīng)用。**測定在技術(shù)上有其特殊性，自動(dòng)化發(fā)展較遲，20世紀(jì)80年代后才有自動(dòng)化分析系統(tǒng)問世。目前除放射**測定外，幾乎所有的**測定方法均可進(jìn)行全自動(dòng)分析。

按分析過程的不同，**測定可分為均相（homogenous）和異相（heterogenous）兩大類。標(biāo)本中的抗原與試劑抗體反應(yīng)后，形成結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物和剩余的游離抗體；測定兩者之一即可計(jì)算出標(biāo)本中抗原的含量。在一般情況下需將結(jié)合的（B）和游離的（F）分離后再進(jìn)行測定，此為異相。在特殊情況下，B和F具有不同的特性，不必分離即可進(jìn)行測定，此為均相。均相和異相兩種**測定在自動(dòng)化系統(tǒng)的設(shè)計(jì)中具有各自的特點(diǎn)。

1、均相**測定

（1） **濁度測定

這是*簡單的**測定方法。標(biāo)本中待測抗原與試劑抗體（一般為特異性抗血清，也可用抗體包被的微粒以提高敏感度）混合，反應(yīng)后形成顆粒性的抗原抗體復(fù)合物而導(dǎo)致反應(yīng)液混濁，而剩余的游離抗體不產(chǎn)生濁度。因此不必進(jìn)行B和F的分離即可通過濁度測定而計(jì)算出標(biāo)本中抗原的含量。 

**濁度可以采用臨床化學(xué)中的透射濁度法（turbidimetry），通過測量透射光的減弱而進(jìn)行測定。因此只要有合適的試劑，可以在生化分析儀中作全自動(dòng)分析。另一種方法為散射濁度法（nephelometry），通過測量顆粒的散射光以反映濁度的強(qiáng)弱。散射濁度儀一般與試劑配套供應(yīng)。全自動(dòng)分析系統(tǒng)有Beckman-Coulter公司的Array和Immage，以及Dade-Behring公司的Nephelometer100和BN ProSpec等。Array和Nephelometer 100已被廣泛應(yīng)用。新型的Immage 和BNProSpec將于2002年在我國推出。**濁度測定的敏感度約為50ng/ml，*適用于測定血漿蛋白的含量。

（2） 均相標(biāo)記**測定

用于小分子物質(zhì)特別是**濃度的測定。模式為競爭法，即標(biāo)記的抗原與標(biāo)本中的抗原競爭結(jié)合特異性抗體，然后進(jìn)行標(biāo)記物的測定。在特定的情況下，與抗體結(jié)合的標(biāo)記物失去其特性，因此不需將B與F分離即可直接測定F中標(biāo)記物的量。

a、 均相酶**測定

1972年Syva公司開發(fā)的酶擴(kuò)大**測定技術(shù)（enzyme-multiplied immunoassaytechnique，EMIT）和1992年Microgenics公司開發(fā)的克隆酶供體**測定（clone enzyme donorimmunoassay，CEDIA）均屬均相酶**測定，酶標(biāo)記的抗原與抗體結(jié)合后，其中的酶就失去其活性。酶活力的測定方法與臨床化學(xué)法相同，因此應(yīng)用這兩種方法的試劑在生化自動(dòng)分析儀即可進(jìn)行標(biāo)本的檢測。也有專用于EMIT和CEDIA的全自動(dòng)分析儀。

b、 熒光偏振**測定

在熒光偏振**測定（fluorescence polarisationimmunoassay，F(xiàn)PIA）中，熒光素標(biāo)記的抗原與標(biāo)本中的抗原競爭結(jié)合特異性抗體，反應(yīng)后用單一平面偏振的光源照射，熒光素被激發(fā)產(chǎn)生偏振熒光。偏振熒光的強(qiáng)度與分子轉(zhuǎn)動(dòng)的速度成反比。標(biāo)記抗原與抗體的復(fù)合物分子量大，旋轉(zhuǎn)慢，偏振熒光強(qiáng)；游離標(biāo)記抗原的分子量小，偏振熒光弱。因此不需進(jìn)行B和F的分離即可進(jìn)行測量。這一技術(shù)在20世紀(jì)80年代即被Abbott公司用于**濃度的測定，其開發(fā)的自動(dòng)分析系統(tǒng)名為TDx。

2、異相**測定

大部分標(biāo)記**測定均屬異相。*常用的B和F的分離手段為固相載體的洗滌，但在臨床化學(xué)測定中無此步驟。因此異相**測定的自動(dòng)化不能借助于生化自動(dòng)分析儀，各種方法均有其特殊的自動(dòng)分析系統(tǒng)。

（1） 固相酶**測定

通用的名稱為ELISA，即酶聯(lián)**吸附劑測定（enzyme linked immunosorbentassay）。在ELISA中通常用聚苯乙烯為固相載體，有微孔板、小管、小珠、微粒、磁性微粒等類型。不同形式的固相載體要求不同的洗滌裝置。 

a、微孔板式自動(dòng)分析儀

不同廠家生產(chǎn)的板式ELISA試劑種類繁多，但均采用規(guī)格統(tǒng)一的8×12的96孔微板。因此儀器廠生產(chǎn)的板式ELISA自動(dòng)分析儀均為"開放式"的，即適用于各家的試劑產(chǎn)品。微孔板每一孔的徹底清洗是ELISA的關(guān)鍵，亦是自動(dòng)分析的難點(diǎn)。因此直至近年才有全自動(dòng)的板式分析儀問世。Bio-Rad公司的CODA自動(dòng)酶**分析儀和Dynex公司的DIAS型微孔板自動(dòng)處理系統(tǒng)均可同時(shí)進(jìn)行多塊微板的全自動(dòng)測定。

b、其他形式固相載體的自動(dòng)分析儀

微孔板以外的固相載體形式，其自動(dòng)分析系統(tǒng)均為試劑與儀器配套型的。

管式載體的特點(diǎn)是小管可同時(shí)作反應(yīng)和比色的容器。BoehringerMannheim公司開發(fā)的ES300型分析儀是管式的配有專用試劑的全自動(dòng)分析系統(tǒng)，在國內(nèi)曾被不少單位采用。但自該公司并入Roche公司以后，各型ES儀器已停止生產(chǎn)。

Abbott公司*早采用0.6cm直徑的小珠作為載體，小珠放在相應(yīng)大小的塑料孔盤中滾動(dòng)沖洗，屬半自動(dòng)類型。Roche公司的COBASCOREⅡ自動(dòng)分析儀則采用粒徑較小的小珠，為全自動(dòng)的分析系統(tǒng)。

Abbott公司應(yīng)用膠乳微粒作為載體的MEIA（微粒子酶**測定）自動(dòng)分析系統(tǒng)較小珠型更為先進(jìn)，膠乳微?？晌皆诓ＡЮw維膜上進(jìn)行洗滌。這種自動(dòng)分析系統(tǒng)稱為IMx，現(xiàn)在與TDx合并組成全能型的Axsym系統(tǒng)。

磁性微粒表面積大，可用磁鐵吸引進(jìn)行分離，是較為理想的載體。瑞士Serono公司的酶**分析儀屬此類型。這種載體已被其他標(biāo)記**測定所采用。

（2） 時(shí)間分辨熒光**測定

早在1941年熒光抗體已應(yīng)用于**組化技術(shù)。但熒光**測定則發(fā)展較遲，作為定量分析必須克服熒光本底高和熒光猝滅的難點(diǎn)。1983年Soini和Kojola用新型的熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物，建立了時(shí)間分辨熒光**測定（timeresolved fluorescenceimmunoassay）。其基本原理是鑭系元素銪螯合物被激發(fā)后產(chǎn)生的熒光壽命比一般的熒光長，因此可待短壽命的本底熒光衰退后再進(jìn)行測量。以此原理開發(fā)的自動(dòng)分析儀稱為DELFIA（dissociation-enhancedlanthanide fluorescenceimmunoassay），現(xiàn)在由芬蘭Wallac公司生產(chǎn)。固相載體亦為微孔板。與板式ELISA分析儀的主要不同點(diǎn)為采用特殊的時(shí)間分辨熒光計(jì)進(jìn)行測量。

（3） 化學(xué)發(fā)光**測定

化學(xué)發(fā)光**測定（chemiluminescenceimmunoassay，CLIA）是近年來發(fā)展的標(biāo)記**測定?；瘜W(xué)發(fā)光底物在化學(xué)反應(yīng)后發(fā)出的光子可通過發(fā)光光度計(jì)（luminometer）進(jìn)行測量?；瘜W(xué)發(fā)光**測定分三種類型，均有自動(dòng)分析儀器供應(yīng)。

a、化學(xué)發(fā)光酶**測定

這是采用化學(xué)發(fā)光劑作為酶反應(yīng)底物的酶標(biāo)記**測定。經(jīng)過酶和發(fā)光兩級(jí)放大，具有很高的靈敏度。Amersham公司早期開發(fā)了以過氧化物酶為標(biāo)記酶、以魯米諾為發(fā)光底物、并加入發(fā)光增強(qiáng)劑以提高敏感度和發(fā)光穩(wěn)定性的化學(xué)發(fā)光酶**測定系統(tǒng)AMERLITE，經(jīng)Johnson& Johnson 公司改良后商品名為VITROS Eci。BeckmanCoulter公司生產(chǎn)的ACCESS應(yīng)用的標(biāo)記酶為堿性磷酸酶，發(fā)光底物為dioxetane磷酸酯，固相載體為磁性微粒。特殊的試劑組合保證了測試的穩(wěn)定性和重復(fù)性。類似的分析系統(tǒng)有DiagnosticProduction Corporation 公司的IMMULITE。

b、化學(xué)發(fā)光**測定

這是以化學(xué)發(fā)光底物直接標(biāo)記抗原或抗體的**測定方法。吖啶酯是較為理想的發(fā)光底物，在堿性環(huán)境中即可被過氧化氫氧化而發(fā)光。Chiron公司生產(chǎn)的ACS180是以吖啶酯為標(biāo)記物、以磁性微粒為載體的自動(dòng)分析系統(tǒng)，可作為這一類型的代表。該儀器現(xiàn)由Bayer公司生產(chǎn)，新的型號(hào)ADVIACENTAUR將于2002年在我國推出。應(yīng)用一種性能優(yōu)良的吖啶酯衍生物，Abbott公司開發(fā)了新型化學(xué)發(fā)光**測定系統(tǒng)ARCHITECT，亦將于2002年在我國上市。

c、電化學(xué)發(fā)光**測定[4]

電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）的原理為：發(fā)光底物二價(jià)的三聯(lián)吡啶釕及反應(yīng)參與物三丙胺在電極表面失去電子而被氧化。氧化的三丙胺失去一個(gè)H+而成為強(qiáng)還原劑，將氧化型的三價(jià)釕還原為激發(fā)態(tài)的二價(jià)釕，隨即釋放光子而恢復(fù)為基態(tài)的發(fā)光底物。這一過程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，不斷地發(fā)出光子而常保持底物濃度的恒定。

Boehringer Mannheim公司利用電化學(xué)發(fā)光原理開發(fā)的**測定系統(tǒng)稱為ELECSYS，1997年投入大量生產(chǎn)。在該系統(tǒng)中并采用鏈霉親和素包被的磁性微粒，配以生物素結(jié)合的抗原或抗體，使反應(yīng)幾乎在液相中進(jìn)行，具有敏感、快速和穩(wěn)定的特點(diǎn)，在固相標(biāo)記**測定中技術(shù)上居**地位。ELECSYS有1010和2010兩種型號(hào)，現(xiàn)由Roche公司生產(chǎn)。新產(chǎn)品為模塊式的E170儀器，將于2002年在我國推出。 

二、**測定簡便化

**測定另一方面的進(jìn)展為簡便化。簡便化的特點(diǎn)是：檢測方法簡單而快速，數(shù)分鐘即可得出結(jié)果；不需儀器設(shè)備，操作人員不需特殊訓(xùn)練；試劑穩(wěn)定，適用于單份測定。近幾年發(fā)展的固相膜**測定[5]完全符合以上要求，成為目前“病人身邊檢驗(yàn)”（point-of-caretesting，POCT）[6]中廣為應(yīng)用的方法。

固相膜**測定的特點(diǎn)是以硝酸纖維素膜為載體和有色微粒作為標(biāo)記物。*常用的標(biāo)記物為紅色的膠體金，因此一般稱為金**測定。在這種測定中，B和F的分離有滲濾和層析兩種形式。 

1、金**滲濾試驗(yàn)

**滲濾試驗(yàn)（immunofiltration assay，IFA）始創(chuàng)于1985年，*初以酶作為標(biāo)記物。1989年DuPont公司推出了用于檢測抗HIV抗體的金**滲濾試驗(yàn)（GIFA），確立了GIFA的基本技術(shù)。

GIFA是只需試劑，不需儀器的檢測方法。試劑盒有兩個(gè)主要組份：一個(gè)為金標(biāo)記的抗體，另一為滲濾裝置。該裝置為一充滿吸水墊料的塑料小盒，盒蓋中央小孔下放置硝酸纖維素膜一片，膜上包被抗體或抗原。試驗(yàn)時(shí)將標(biāo)本滴加膜上，通過滲濾抗原抗體在膜上反應(yīng)；然后滴加金標(biāo)抗體，滲濾反應(yīng)如上。陽性結(jié)果在膜上出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。全過程在數(shù)分鐘內(nèi)完成。 

90年代初期GIFA展開了多方面的研究和開發(fā)，用于檢測各種傳染病的抗體和腫瘤標(biāo)志物等。國內(nèi)1991年即有GIFA試劑生產(chǎn)，用于檢測尿液HCG的“金標(biāo)”早孕診斷試劑取得了廣泛應(yīng)用。

2、金**層析試驗(yàn)^[6] 

1990年Oskiowicz等建立了**層析試驗(yàn)（immunochromatographyassay,ICA），其原理與IFA相同；不同點(diǎn)在于液體的移動(dòng)不是通過直向的穿流（flowthrough），而是基于層析作用的橫流（lateralflow）。Oskiowicz應(yīng)用的標(biāo)記物為膠體硒，其后一般均采用簡便的膠體金，稱為金**層析試驗(yàn)（GICA）。 

GICA試劑為試紙條形式。在一塑料片條上依次粘貼如下組份：（1）吸水紙；（2）玻璃纖維膜，膜上固定著干燥的金標(biāo)抗體；（3）硝酸纖維素膜，膜上包被著線條狀的抗體；（4）吸水紙。以上各組份首尾互相銜接，因此在（1）處滴加液體標(biāo)本，液流即向（4）處移動(dòng)。當(dāng)液體到達(dá)（2）處時(shí)，金標(biāo)抗體被溶解，同時(shí)與標(biāo)本中的抗原反應(yīng)而形成復(fù)合物。液流繼續(xù)前移至（3），金標(biāo)記的復(fù)合物再與膜上的抗體結(jié)合而呈現(xiàn)紅色的線條，多余的金標(biāo)抗體繼續(xù)前移至（4）處。

GICA的特點(diǎn)是單一試劑，一步操作。干燥包裝的試劑可在室溫保存一年以上。 

GICA試劑結(jié)構(gòu)簡單，小型實(shí)驗(yàn)室即有條件開發(fā)生產(chǎn)。近年來發(fā)展生產(chǎn)GICA試劑的單位如雨后春筍，目前試劑的品種已多達(dá)數(shù)十種，測定項(xiàng)目包括HCG、LH等**，腫瘤標(biāo)志物，傳染病的抗原和抗體，心血管病標(biāo)志物等，并有繼續(xù)發(fā)展的趨勢。

金**測定中應(yīng)用的是單份試劑，難于進(jìn)行質(zhì)量控制[7]。即使是同一批生產(chǎn)的試劑，也很難保證每個(gè)試劑的同一性。因此金**測定一般只能用于定性試驗(yàn)。*近由于原料的精選和制作工藝的改進(jìn)，已能制備出可用于定量測定的GICA試劑。Roche公司生產(chǎn)的用于急性心肌梗死診斷的肌鈣蛋白和肌紅蛋白的GICA試劑和匹配的簡便測讀器CardiacReader，其精密度和準(zhǔn)確性均符合定量測定要求[7]。另一種類似的定量測定心肌標(biāo)志的**層析測定系統(tǒng)，應(yīng)用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物，由美國Biosite公司生產(chǎn)，商品名TRIAGECardiac Panel[6]。 

三、結(jié)束語

隨著**學(xué)技術(shù)和自動(dòng)化技術(shù)的發(fā)展，**學(xué)測定取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。值得注意的是，不論自動(dòng)化還是簡便化，直接的研究和開發(fā)幾乎全部由生產(chǎn)單位所推動(dòng)?；仡檱鴥?nèi)，國產(chǎn)自動(dòng)分析儀尚屬空白；國內(nèi)**測定試劑的生產(chǎn)正在向高質(zhì)量和穩(wěn)定性方面努力，**產(chǎn)品鳳毛麟角?？上驳氖沁M(jìn)入新世紀(jì)以來，在簡便化的領(lǐng)域內(nèi)已研發(fā)出與國際同步的檢測系統(tǒng)，如AFP和HCG的金標(biāo)定量測定系統(tǒng)和測定腫瘤標(biāo)志的蛋白芯片系統(tǒng)均即將問世。相信在不久的將來在**測定的領(lǐng)域中我們一定能躋身于國際先進(jìn)行列。 

參考文獻(xiàn)

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3、Chan DW.Automation of immunoassays.In:Diamandis EP,ChristopoulosTK,eds.Immunoassay.San Diego:Academic Press,1996,483-504
4、鄭佐婭,陶義訓(xùn).電化學(xué)發(fā)光**測定.臨床檢驗(yàn)信息,1998,5:10-12
5、陶義訓(xùn).固相膜**測定.上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,2000,15:258-260
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